Signaltransduktion in Phytochrom-Diguanylatzyklase Systemen

Im Laufe der Evolution hat die Natur eine beeindruckend modulare Architektur von gekoppelten Proteindomänen entwickelt. Unter Verwendung von Komponenten unterschiedlicher Funktionalitäten, wie zum Beispiel Sensordomänen von Umwelteinflüssen, Interaktionsmodulen oder Enzymen, konnten Organismen komplexe zelluläre Netzwerke aufbauen, die essentiell für deren Überleben sind. Die häufig beobachtete Verknüpfung von Sensormodul und enzymatischer Funktionalität ermöglicht etwa die direkte Kontrolle der zellulären Konzentration von wichtigen Signalbotenstoffen, die eine Anpassung der Organismen an wechselnde Umweltbedingungen ermöglichen. In jüngster Zeit gerieten vor allem lichtregulierte Systeme in den Fokus der Wissenschaftler, da es vielfältige Anwendungsgebiete im Bereich der Optogenetik, einer Forschungsrichtung bei der genetisch modifizierte biologische Systeme mit Hilfe von Lichtsignalen gezielt beeinflusst werden, gibt. Allerdings sind die Anforderungen an lichtregulierbare Systeme komplexer als die Möglichkeiten die natürlich vorkommende Photorezeptoren im Laufe der Evolution entwickelt haben. Obwohl in den letzten Jahren wesentliche Fortschritte im Verständnis der Lichtaktivierung erzielt wurden, ist ein rationales Design künstlicher lichtregulierter Systeme noch immer eine Herausforderung. Speziell da sich mechanistische Beschreibungen der Signalweiterleitung sogar innerhalb gleicher Phororezeptordomänen unterscheiden, erscheint ein besseres Verständnis der Modularität von Sensor-Effektor Kombinationen erforderlich. Das Projekt Signaltransduktion in Phytochrom-Diguanylatzyklase Systemen zielt darauf ab molekulare Mechanismen der Lichtregulation in Rotlicht-kontrollierten Diguanylatzyklasen, die eine Rolle bei der Bildung eines wichtigen bakteriellen Signalbotenstoffes spielen, besser zu verstehen. Die Identifikation wichtiger struktureller Signalelemente sowie regulatorischer Elemente der Effektordomäne wird neue Einblicke in Prinzipien der modularen Kopplung von natürlich vorkommenden Sensor-Effektor Systemen ermöglichen. Um einen ganzheitlichen Einblick in diese Systeme zu erlangen verwenden wir einen interdisziplinären Ansatz, bei dem wir biochemische, biophysikalische und strukturbiologische Methoden miteinander kombinieren. So soll die Interpretation von Strukturmodellen aus dem Bereich der Kristallografie mit einer Charakterisierung der in Lösung vorkommenden dynamischen Prozesse erweitert werden. Dies soll detaillierte Einblicke in funktionell relevante Strukturelemente, sowohl im Rahmen der Lichtaktivierung als auch der Signalweiterleitung zum Effektor, ermöglichen. Die Integration der Resultate von unterschiedlichen Sensor- Effektorkombinationen wird wesentlich zu einem besseren Verständnis der Signalweiterleitung zwischen den Domänen beitragen. In weiterer Folge ermöglicht dies neue Einblicke in die molekularen Regulationsmechanismen natürlich vorkommender modularer Systeme und gezieltere Ansätze im rationalen Design von künstlichen Sensor-Effektor Kombinationen, die im Bereich der Optogenetik Anwendung finden werden. Längerfristig könnten so neue Hilfsmittel für Wissenschaftler entstehen, die es ermöglichen werden biologische Fragestellungen zu behandeln, die gegenwärtig undenkbar sind.

Sensor-Effektor Proteine verarbeiten Signale verschiedener Reize und wandeln diese in zelluläre Antworten um. Einige sensorische Domänen, wie die auf Rotlicht reagierenden Bakteriophytochrome, weisen eine bemerkenswerte Modularität auf und regulieren in der Natur eine Vielzahl von Effektoren. Eine dieser Effektordomänen ist die GGDEF-Diguanylatzyklase, die die Bildung des bakteriellen Botenstoffs zyklisches-dimeres Guanosinmonophosphat katalysiert, der eine zentrale Rolle bei der Ausbildung verschiedener zellulärer Zustände in Bakterien spielt. Während kritische Signalintegrationselemente für eine Reihe von Phytochromen verschiedener Modellsysteme beschrieben wurden, fehlt ein allgemeines Verständnis der Signalverarbeitung und Kommunikation über große molekulare Distanzen, etwa 10 nm in Phytochrom-Diguanylatzyklasen. In diesem Projekt haben wir gezeigt, dass die dynamikgesteuerte Allosterie der dimeren Bakteriophytochrome der Schlüssel zum Verständnis der Signalintegration auf molekularer Ebene ist. Wir haben auch gezeigt, dass die globale Dynamik von Sensor- und Effektor-Domänen durch eine Vielzahl von Strukturelementen beeinflusst wird, darunter die Umgebung des lichtsensitiven Kofaktors, benachbarte Elemente der Chromophor-Umgebung ("PHY-tongue" und N-terminales Segment), und sogar die Dimer-Schnittstelle einer weiteren Domäne, die die Verbindung zum zentralen Sensor-Effektor-Linkerbereich dem "coiled-coil" herstellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Länge des letztgenannten Elements unter erheblichem evolutionärem Druck steht und den dynamischen Bereich der Effektor-Aktivierung deutlich beeinflusst. Darüber hinaus haben wir die funktionelle Bedeutung von Dimeren mit gemischten funktionellen Zuständen anhand einer Variante mit schneller Hell-Dunkel-Umkehr nachgewiesen, die immer noch eine hohe Stimulation der enzymatischen Aktivität durch rotes Licht ermöglicht. Diese Beobachtung unterstützt die funktionelle Rolle der Aktivierung einzelner Protomere in Phytochromen, eine Eigenschaft, die mit den nicht-kanonischen Spektren korrelieren könnte, die für viele Phytochrom-Systeme beobachtet werden. Diese Erkenntnisse wurden durch die Kombination biochemischer und spektroskopischer Analysen mehrerer Phytochrom-aktivierter Diguanylatzyklase (PadC)-Homologe mit strukturellen Analysen der Konformationsdynamik unter Verwendung von Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Experimenten in Verbindung mit Massenspektrometrie gewonnen. Wir haben festgestellt, dass die Konformationsdynamik mit der enzymatischen Aktivität dieser Proteine korreliert und dass die Dynamik in künstlichen Proteinvarianten vom Ort der Lichtabsorption entkoppelt werden kann. Wir gehen davon aus, dass unsere Ergebnisse die Forschung in Richtung dynamikgesteuerter allosterischer Kontrolle verschiedener Bakteriophytochrom-basierter Sensor-Effektor Systeme anregen werden. Darüber hinaus ist die Berücksichtigung von Sensor-Effektor-Linkern als signalverarbeitende Strukturelemente, und ihre Koevolution mit Teilen der sensorischen Bereiche, ein wichtiger Schritt in Richtung rational entwickelter optogenetischer Werkzeuge; spezifisch die Verwendung unterschiedlicher Phytochrom-Bausteine um verschiedene Systemantworten zu erzielen. Dies wird sich letztendlich auf Designstrategien für die Schaffung neuartiger Sensor-Effektor-Systeme zur Erweiterung der Palette an optogenetischen Systemen auswirken.