Regulation der Triacylglycerol-Lipasen in Hefe

Bei einem Überangebot an Nährstoffen bilden eukaryotische Zellen Triacylglycerole (TAGs) als Speicherlipide. Diese wichtigen Speicherlipide werden in speziellen Organellen deponiert, welche als Lipidpartikel oder Lipidtröpfchen (lipid particles, lipid droplets) bezeichnet werden. Bei Nährstoffmangel wiederum werden TAGs abgebaut, um die Zelle mit Energie, aber auch mit Bausteinen für die Bildung von Membranlipiden zu versorgen. Die Enzyme, welche den Abbau der TAGs katalysieren, sind sogenannte TAG-Lipasen. Diese Enzyme befinden sich auf der Oberfläche der Lipidpartikel, wodurch sie in unmittelbarer Nähe ihres Substrats, den TAGs, sind. Daher stellt sich die Frage, wie die Regulation der TAG-Lipase Aktivität erfolgt um sicherzustellen, dass der Abbau von TAGs nur bei Bedarf erfolgt, jedoch nicht in der Phase der TAG Akkumulation. In dem hier vorgeschlagenen Projekt werden wir diese fundamentale Frage an Hand des Modellorganismus Hefe, Saccharomyces cerevisiae, untersuchen. Die drei wichtigsten TAG-Lipasen der Hefe sind Tgl3p, Tgl4p und Tgl5p. Diese drei TAG-Lipasen wurden in globalen Studien als sogenannte Phosphoproteine identifiziert, welche an mehreren Stellen durch Phosphorylierung modifiziert sind. Die Phosphorylierung oder De-phosphorylierung eines Proteins stellt für eine Zelle ein sehr wirksames Werkzeug dar, um die Eigenschaften dieses Proteins zu verändern. Unsere Hypothese ist, dass die lipolytische Aktivität der TAG-Lipasen über Proteinphosphorylierung reguliert und dadurch der Abbau der TAGs an die zellulären Bedürfnisse angepasst wird. In diesem Projekt werden wir drei spezielle Aspekte der TAG Lipolyse untersuchen: (a) Welche Phosphorylierungsstellen der TAG- Lipasen sind an der Regulation ihrer Aktivität beteiligt? (b) Welche Proteinkinasen führen die Phosphorylierungen an den regulatorischen Stellen der TAG-Lipasen durch? Und (c) spielen auch TAG Spezies und/oder die Menge an TAGs eine Rolle bei der Regulation der TAG-Lipasen? Bei unseren Untersuchungen werden verschiedene Methoden der Molekularbiologie, Zellbiologie und Biochemie zum Einsatz kommen. Alle für dieses Projekt benötigten Methoden sind in unserem Labor entweder bereits gut etabliert, oder werden von Kollaborationspartnern, welche Experten auf diesen Gebieten sind, durchgeführt. Von unseren Resultaten kann erwartet werden, dass sie zu neuen Einsichten in den fundamentalen Prozess der TAG Lipolyse führen, und - da der Lipidmetabolismus von der einfachen Hefe bis hin zum Menschen evolutionär hoch konserviert ist, - auch zu einem besseren Verständnis dieses komplexen Prozesses in höheren Eukaryoten beitragen.

Innerhalb einer Zelle werden Triglyzeride (TG) in speziellen Zellorganellen, welche Lipidpartikel (LP) genannt werden, gespeichert. Die Struktur dieser Organelle ist recht einfach. TG und andere hydrophobe Moleküle bilden einen hydrophoben Kern, welcher vom Zytosol durch eine Phospholipid-Monoschicht abgeschirmt wird, in welche wenige Proteine eingebettet sind. Unter den Proteinen, die das LP Proteom bilden, sind auch TG-Lipasen. Diese Enzyme katalysieren den Abbau von TG, wodurch Diglyzeride und freie Fettsäuren der Zelle zur Verfügung stehen. Diese beiden TG-Abbauprodukte dienen nicht nur als Energiequelle, sondern auch als Bausteine für den Aufbau von Membranlipiden. Für die Aufrechterhaltung eines ausgeglichen Stoffwechsels ist es von höchster Wichtigkeit, dass die Enzymaktivität von TG-Lipasen an die zellulären Bedürfnisse angepasst ist. In diesem Forschungsprojekt untersuchten wir die Grundmechanismen der Regulation der TG-Lipase Aktivität. Für diese Untersuchungen diente uns die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus. Den Fokus legten wir auf die beiden Haupt-TG-Lipasen der Hefe, Tgl3 und Tgl4, die beide auf LP lokalisieren [1-3]. Globale Untersuchungen zeigten, dass die TG-Lipase Tgl4, ein Homolog der Adipose-Triglyzerid-Lipase ATGL der Säuger, an zahlreichen Aminosäuren im Bereich des C-terminus post-translational durch Phosphorylierung modifiziert wird. Um die Bedeutung der Phosphorylierung von Tgl4 in diesem Bereich zu untersuchen, generierten wir eine Reihe von Mutanten, die jeweils eine Tgl4-Variante exprimieren, der ein Teil des C-terminus fehlt. Mit diesen Mutanten konnten wir zeigen, dass der C-terminus von Tgl4 weder an der Verankerung der Lipase an LP beteiligt ist, noch deren Proteinstabilität reguliert. Der C-terminus spielt jedoch eine wesentliche Rolle bei der Regulation der lipolytischen Aktivität von Tgl4. Unsere detaillierten Studien zeigten, dass unter physiologischen Bedingungen die Phosphorylierung/De-phosphorylierung einer Aminosäure im mittleren Bereich des C-terminus eine bedeutende Rolle hinsichtlich der Regulation der lipolytischen Aktivität von Tgl4 spielt. Wie Tgl4, wird Tgl3, die Hauptlipase der Hefe, durch Phosphorylierung post-translational modifiziert. Mit Hilfe von Mutanten, die Tgl3-Varianten mit spezifischen Phosphorylierungsdefekten exprimieren, konnten wir zeigen, dass über eine bisher noch nicht charakterisierte Phosphorylierungsstelle der Beitrag dieser Lipase zum Zellmetabolismus reguliert wird. Eine Veränderung des Phosphorylierungsstatus an dieser Aminosäure beeinflusst die Proteinstabilität der Lipase und reguliert somit indirekt den Beitrag Tgl3s zum Zellmetabolismus. Des Weiteren konnten wir im Laufe dieses Forschungsprojekts eine Verbindung zwischen der TG-Synthese, der LP-Biogenese und der Haupt-TG-Lipase Tgl3 identifizieren. Es ist geplant diese vielversprechende Studie in naher Zukunft fortzusetzen. Referenzen: 1. Athenstaedt, K., and Daum, G. (2003) J. Biol. Chem. 278(26):23317-23323. DOI: 10.1074/jbc.M302577200 2. Athenstaedt, K., and Daum, G. (2005) J. Biol. Chem. 280:37301-37309. DOI: 10.1074/jbc.M507261200 3. Kurat, C. F., Wolinski, H., Petschnigg, J., Kaluarachchi, S., Andrews, B., Natter, K., and Kohlwein, S. D. (2009) Mol. Cell 33:53-63. DOI: 10.1016/j.molcel.2008.12.019