Proteolyse Kontrolle von RpoS und RssB in Vibrio cholerae

Cholera ist eine lebensbedrohliche Durchfallerkrankung die durch das human-pathogene Bakterium Vibrio cholerae hervorgerufen wird. Verantwortlich für die Erkrankung ist ein ausgeprägtes und komplexes Regulationssystem, welches die Virulenzgeneexpression kontrolliert. Dieses Regulationsnetzwerk wird durch eine Anzahl an sensorischen Komponenten beeinflusst, z.B. durch Sensorregulatoren, Sigmafaktoren, regulatorische RNA, überlappende Regulone und einem Hauptsystem, welches als das ToxR Regulon bezeichnet wird. Letzteres ist direkt bei der Expressionskontrolle von Toxinen und Kolonisierungsfaktoren involviert. Der Fokus dieses Projektes liegt auf einem assoziierten Regelkreis, der sich zwischen Wirtsadaptation und Umweltsignalen einfügt. Dieser Regelkreis wird von dem alternativen Sigmafaktor RpoS und dem dazugehörigen Anti-Sigmafaktor RssB beeinflusst, welcher bei Gram- negativen Bakterien weit verbreitet ist. Bisher wurde dieser Komplex nur in Escherichia coli, Salmonella enterica sv Thypimurium, und wie von uns gezeigt, in V. cholerae untersucht. Derzeit thematisieren nur wenige Veröffentlichungen tiefer gehende physiologische Charakterisierungen von RpoS/RssB in anderen Bakterien, vor allem nicht in human pathogenen Erregern. Aus den aktuellen Daten schließen wir, dass das Regulationsprinzip konserviert sein muss und die assoziierten Ein- und Ausgangswege ersetzbar sind. Abhängig von den optimalen Überlebensstrategien, können RpoS/RssB unterschiedliche Reaktionen auszulösen. In E. coli ist RpoS wichtig für die Aktivierung eines Notprogrammes sobald die Zellen auf ungünstige Wachstumsbedingungen treffen. Als Antwort wird durch die RpoS Regulation die Zellphysiologie angepasst, sodass diese Stresssituation längst möglich überdauert werden kann. Sofern Wirtsbedingungen einen Hungerzustand erzeugen, könnte eine RpoS Antwort zu einer erhöhten Persistenz der E. coli Bakterien führen, wodurch der kritische Zustand überdauert werden kann. Im Gegensatz dazu ist V. choleraehauptsächlich ein freilebenderund marinerOrganismus.Wenn dieseSpezies Hungerbedingungen erfährt müssen neue Nahrungsquellen gefunden werden. Daher ist es plausibel, dass die Motilität und Chemotaxis in V. cholerae durch RpoS/RssB aktiviert werden muss. Zusammengefasst gesagt, RpoS/RssB sind weit verbreitet innerhalb der Gram-negativen Spezies, aber der Komplex nimmt unterschiedliche Funktionen für globale Überlebensstrategien wahr. Als solches vermittelt RpoS/RssB in V. cholerae einen Einfluss auf das Virulenzprogramm durch Aktivierung der Motilität. Diese kann den Ablauf der Infektion bedeutend beeinflussen, da die Motilität mit der initialen Kolonisierung, als auch mit der Termination der Infektion im Zusammenhang steht. In unserem Projekt sollen die molekularen Mechanismen der regulierten Proteolyse von RpoS und RssB unter Labor- und Kolonisierungbedingungen charakterisiert werden. Ein mögliches Ziel könnte hierbei sein, den RpoS/RssB Regulationskreis so zu beeinflussen, dass der Infektionsprozess gestört wird. In längerfristigen Forschungen sollen Substanzen gefunden werden, welche den Infektionsablauf inhibieren und so beispielsweise zu Verkürzung oder gar Abbruch der Cholera-Infektion im Patienten führen.

Die Cholera ist eine Erkrankung die weiterhin unter den Durchfallserkrankungen eine signifikante Bedrohung durch pandemische Ausbrüche weltweit darstellt. Diese Erkrankung wird durch Bakterien der Spezies Vibrio cholerae ausgelöst. Solche Bakterien finden sich in aquatischen Meeresbereichen und Flussoberläufen aber auch in Seen und Tümpel und gelangen durch Verunreinigungen mit Trinkwasser und Lebensmittel in Kontakt mit den Menschen. Im Menschen erzeugen sie eine derart heftige sekretorische (stak flüssig) Diarrhoe (Durchfall), dass vor allem Kleinkinder und ältere Menschen durch Organversagen mittels Dehydrierung schnell versterben können. Übergänge des Lebenszyklus von V. cholerae Bakterien zwischen Umwelt und dem Wirt Mensch setzten signifikante Veränderungen des Verhaltens und damit der Genregulation bei V. cholerae voraus. Ein Gensteuerungsregelkreis, der dafür sorgt, dass die Bakterien in der Umweltphase beweglich sind, um dann während der Kolonisierung im Mensch diese Beweglichkeit an-und abschalten, umfasst einen Sigmafaktor, das sogenannte RpoS Protein. Dieses Protein ist wichtig und erkennt die verändernden Umwelteinflüsse. Vor allem aber ist es ein Sensor, welcher Hungerzustände wahrnimmt und dann entweder die Zellen auf Flucht und Mobilität schaltet (RpoS-ein) oder genügend Nährstoffreichtum erkennt und die Mobilität abschaltet (RpoS-aus). Ebenso erkennt RpoS auch Hungerzustände im Wirt (späte Phase der Cholera) und aktiviert die Mobilität, dabei schwimmen die V. cholerae Bakterien von der Kolonisierungsstelle (Darm) weg und verlassen den Wirt durch die Ausscheidung im Durchfall. Zur Vermittlung dieser Aktivität haben wir in diesem Projekt in V. cholerae nachgewiesen, dass dazu regulierte Proteolyse (Abbau) von RpoS stattfindet (ähnlich wie auch gezeigt für Escherichia coli). Dabei wird ein "Ziel genauer Abbaufaktor" Faktor (RssB) von einer Sensorkinase (ArcB) phosphoryliert (reiche Nährstoffumgebung) und damit der Abbau von RpoS stark beschleunigt. Bedeutet, unter Hungerbedingungen ist RpoS stabil und unter reichen Nährstoffbedingungen sehr instabil. Damit konnten wir im Wesentlichen die Funktion von RpoS in V. cholerae bestätigen. Interessanterweise funktioniert das System in V. cholerae konträr zu E. coli. Bedeutet, dass RpoS in V. cholerae genützt wird, um vor Hungerbedingungen zu flüchten und um neue Nährstoffe zu finden. In E. coli aber wird diese RpoS Funktion gebraucht um Hungerbedingungen so lang wie möglich zu überleben ohne zu flüchten. Daher zeigten wir in diesem Projekt wie ähnliche molekulare Mechanismen durch die Evolution in unterschiedlichen Strategien des Überlebens genützt werden können. Zusätzlich konnten wir einen neuen Regulationskreis aufzeigen, wonach Aminosäuren zusammen mit RpoS und anderen Regulatoren die Sekretion von Proteasen aktiviert, um proteinreiche Nahrungsquellen zu erschließen. Letzter Studien befinden sich noch unter Vorbereitung zur Publikation und wird vorgeschlagen für weitere Förderung.