Typ 3 Kupferproteine

Polyphenoloxidasen (PPOs) sind eine Gruppe von Typ-III-Kupfer Metalloenzymen zu denen Tyrosinasen (TYRs), Catecholoxidasen (COs) und Auronsynthase (AUS) gehören. TYRs katalysieren die ortho-Hydroxylierung von Monophenolen (Monophenolase Aktivität) und die darauffolgende Oxidation der entstehenden ortho-Diphenole zu ortho-Chinonen (Diphenolase Aktivität), wohingegen COs nur die letztere Reaktion katalysieren können. Die Chinone sind hochreaktiv und sie stellen die Ausgangsverbindungen für die Biosynthese von Melanin dar. PPOs sind somit an der Pigmentbildung beteiligt. AUS katalysiert die Synthese von Auronen ausgehend von Chalkonen und ist somit an der Gelbfärbung von einigen Zierpflanzen beteiligt. Unser Fortsetzungsprojekt fokussiert sich auf die PPOs des essbaren Pilzes Agaricus bisporus (AbPPO) und der AUS aus Coreopsis grandiflora (CgAUS1). Die Gene des Pilzes kodieren für 6 verschiedene PPOs (AbPPO1-6), aber nur AbPPO3 und 4 werden in großen Mengen im Champignon selber produziert. PPO4 ist das am meisten untersuchte Enzym. Da es bereits ein etabliertes Protokoll für die Expression von AbPPO4 gibt, ist es unser Ziel die restlichen Champignon-Tyrosinasen (AbPPOs) rekombinant zu expremieren und biochemisch zu charakterisieren, was auch Kristallisationsexperimente beinhaltet. Mit Hilfe von Aktivitäts- Assays, werden wir untersuchen, ob alle AbPPOs an der Bräunugsreaktion von Champignons beteiligt sind und damit die Frage adressieren, warum Champignons sechs PPOs besitzen. Die Ergebnisse der Experimente werden die Substrat-Präferenz der AbPPOs näher spezifizieren und hoffentlich die physiologische Funktion der PPOs erhellen. Zudem werden wir die AbPPOs zu Quervernetzungsreaktionen einsetzen, was eine mögliche Anwendung dieser als Unterwasser-Kleberzur Folge habenkann. An CgAUS1 planen wir ausführliche Mutationsstudien durchführen, wobei wir Aminosäuren mutieren werden, die sich in der zweiten Schale um das aktive Zentrum befinden. Anschließende Aktivitäts-Assays werden dann die Aminosäuren identifizieren, die eine wichtige Rolle für die Aktivität des Enzyms spielen, da wir davon ausgehen, dass einige Mutationen AUS in eine reine CO und andere wiederum in eine reine TYR verwandeln. Die CgAUS1-Mutante mit der höchsten Monophenolase (TYR)-Aktivität soll dann kristallisiert werden, um durch den Vergleich der Mutanten- und Wildtyp-Struktur strukturelle Einblicke in den Katalyse-Mechanismus zu erhalten. Alle angestrebten Ergebnisse werden deutlich zum Wissen über den katalytischen Mechanismus von CgAUS1 und PPOs im Allgemeinen beitragen und Erkenntnisse über die Mono-/Diphenolase Diskrepanz von PPOs liefern. Basierend auf den gewonnenen biochemischen und strukturellen Erkenntnissen über CgAUS1 (und dessen Mutanten), werden wir spezifische Inhibitoren designen, die bestimmte strukturelle Merkmale angreifen, die für die Aktivität des Enzyms unverzichtbar sind und damit den ersten zielgerichteten Inhibitor designen. 1

Polyphenoloxidasen (PPOs) stellen eine Familie von Typ-III-Kupfermetalloenzymen dar, zu denen Tyrosinasen (TYRs), Catecholoxidasen (COs) und die Auronsynthase (AUS) gehören. TYRs katalysieren die ortho-Hydroxylierung von Monophenolen (Monophenolaseaktivität) und die anschließende Oxidation der resultierenden ortho-Diphenole zu ortho-Chinonen (Diphenolaseaktivität), während COs nur die letztere Reaktion katalysieren können. Die ortho- Chinone sind hochreaktiv und stellen das Ausgangsmaterial für die Biosynthese von Melanin dar und somit sind PPOs an der Pigmentbildung beteiligt. Unsere Forschungsziele waren die ertragsstarke Produktion sowie die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Pflanzen-PPOs aus Aprikose, Longan, und dem Mädchenauge, um Kenntnisse über den strukturellen Unterschied im Aufbau des aktiven Zentrums von TYRs und COs zu gewinnen. Wir haben erstmals eine Catecholoxidase zu einer Tyrosinase mutiert und damit die Aminosäurereste, die für die Tyrosinaseaktivität verantwortlich sind, identifiziert und einen neuen Reaktionsmechanismus für die Tyrosinaseaktivität entwickelt. Inhibierungen der PPO- Aktivität wurden mit organischen und rein anorganischen Verbindungen durchgeführt. Bei den pilzlichen Tyrosinasen wurde die vollständige Agaricus bisporus (AbPPO1 -6) Tyrosinase- Familie aus mRNA kloniert und heterolog exprimiert. Alle sechs Isoenzyme akzeptieren ein breites Spektrum an mono- und diphenolischen Substraten, weisen jedoch ausgeprägte Unterschiede in ihrer Spezifität und enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit auf. In Kooperation mit Wissenschaftlern der HU Berlin haben wir mit Hilfe der Agaricus bisporus Tyrosinase das Konzept der künstlichen Muschel-Klebeproteine erweitert, indem wir ein Sequenzmodul zur Kohäsionssteuerung integriert haben. Da Umweltaspekte für das gesunde Überleben der Menschheit eine immer größere Bedeutung erlangen, haben wir die Rolle der bakteriellen Tyrosinasen in Mooren und im geochemischen Kreislauf zusätzlich zu dem ursprünglich geplanten Vorhaben untersucht. Um überzeugende Beweise für das neuartige Konzept, in dem bakterielle Tyrosinasen zu den Schlüsselenzymen gehören, die den Kohlenstoffkreislauf in Feuchtgebietsökosystemen beeinflussen, zu liefe rn, wurden zunächst bakterielle Organismen identifiziert, die in Feuchtgebietsökosystemen heimisch sind und ein TYR-Gen in ihrem jeweiligen Genom (tyr+) enthalten, was die phylogenetische vielfältige Gemeinschaft von Tyr+-Bakterien, die in Feuchtgebieten heimisch sind, lieferte. Aufgrund des Klimawandels kommt es zu einer verstärkten Belüftung von zuvor anoxischen Feuchtgebietsböden und die TYRs gehören zu den Enzymen, die in der Lage sind, die Konzentration von Phenolverbindungen in Feuchtgebietsökosysteme n zu reduzieren, was wahrscheinlich große Mengen an in diesen Ökosystemen gespeichertem Kohlenstoff destabilisieren wird, und als Kohlenstoffdioxid freisetzt.