Neue Einblicke in die Biofilmbildung von Vibrio cholerae

Die schwere Durchfallerkrankung Cholera wird durch das fakultativ human- pathogene Bakterium Vibrio cholerae verursacht. Der Lebenszyklus von klinisch relevanten V. cholerae Isolaten ist vom ständigen Wechsel zwischen zwei sehr unterschiedlichen Lebensweisen geprägt: Als natürlicher Bewohner der aquatischen Umwelt und als Krankheitserreger im menschlichen Gastrointestinaltrakt. Ein entscheidender Faktor für das Überleben in der Umwelt ist die Fähigkeit Oberflächen-assoziierte Gemeinschaften auszubilden, welche von einer extrazellulären Matrix zusammengehalten werden - besser bekannt unter dem Begriff Biofilm. Neueste Studien lassen vermuten, dass Biofilme nicht nur eine wichtige Rolle als Überdauerungsstadium in der Umwelt spielen, sondern auch einen effizienten Weg darstellen, um hohe Keimzahlen auf den nächsten Wirt zu übertragen. Daher tragen Biofilme von V. cholerae auch zur Verbreitung der Krankheit Cholera bei. Unter Verwendung eines Reportergen-Systems konnten wir innerhalb der vorherigen Förderperiode erfolgreich Gene identifiziert, welche während der Biofilmbildung von V. cholerae induziert werden. Inzwischen haben wir dieses Reportersystem weiterentwickelt und sind nun in der Lage auch Gene identifizieren, welche unter bestimmten Bedingungen ausgeschaltet werden. Im Rahmen dieses Projekts wollen wir diese neue Version des Reporter-Systems verwenden, um gezielt Gene zu finden, welche im Biofilm abgeschaltet werden. So lassen sich Faktoren erforschen, die in der Biofilm-Phase nicht gebraucht werden oder sogar bei der Biofilmbildung schädlich sind. Dadurch könnten sich neue Angriffsziele von bakteriellen Biofilmen ergeben. Im zweiten Teil des Projekts werden wir uns mit der Rolle von bakteriellen Aussenmembranvesikeln im Rahmen der Biofilmbildung beschäftigen. Die kugelförmigen Aussenmembranvesikel lösen sich ständig von der bakeriellen Oberfläche ab. Bislang ist noch weitgehend unbekannt warum Bakterien diese Vesikel bilden. Wir konnten bereits zeigen, dass Aussenmembranvesikel über ein bislang uncharakterisiertes Protein (hier ObfA) die Biofilmbildung fördern. Es gibt dabei erste Hinweise, dass ObfA ein bislang unbekannter Faktor der sogenannten Quorum sensing-Kaskade ist, welcher maßgeblich Biofilmbildung reguliert. Entlang des Projekts wollen wir die Bindepartner von ObfA und die mechanistischen Details dieser Regulation aufdecken. Da ObfA-ähnliche Proteine auch in anderen Bakterien vorkommen, können unsere Ergebnisse möglicherweise auch auf andere Bakterien übertragen werden. Insgesamt sollen die Ergebnisse dieser Studie das Verständnis der Biofilmbildung von V. cholerae und eventuell auch anderer Bakterien verbessern. Idealerweise wird dies die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beschleunigen, die auf die Persistenz und übertragbaren Formen von pathogenen Bakterien wie V. cholerae abzielen.

Die schwere Durchfallerkrankung Cholera wird durch das fakultativ humanpathogene Bakterium Vibrio cholerae verursacht. Klinisch relevante V. cholerae-Isolate wechseln zwischen zwei unterschiedlichen Lebensweisen: als frei lebende Organismen in aquatischen Umgebungen und als Krankheitserreger im menschlichen Gastrointestinaltrakt. Ein entscheidender Faktor für das Überleben in der Umwelt ist die Fähigkeit, oberflächenassoziierte Gemeinschaften zu bilden, die als Biofilme bezeichnet werden und in eine extrazelluläre Matrix eingebettet sind. Biofilme dienen nicht nur als Überdauerungsstadium in der Umwelt, sondern erleichtern auch die Übertragung hoher Bakterienzahlen auf neue Wirte und tragen somit zur Ausbreitung der Cholera bei. In diesem Projekt verwendeten wir ein transkriptionelles Reportersystem, die TetR-kontrollierte rekombinationsbasierte In-Biofilm-Expressionstechnologie (TRIBET), um Gene zu identifizieren, die während der Biofilmbildung gezielt abgeschaltet werden. Mit diesem Ansatz konnten wir 192 sogenannte in-Biofilm-reprimierte (ibr) Gene identifizieren. Diese Gene sind an unterschiedlichen zellulären Prozessen beteiligt, darunter Stoffwechsel, Regulation, Oberflächenassoziation, transmembraner Transport sowie Motilität und Chemotaxis. Die konstitutive Überexpression ausgewählter ibr-Gene beeinträchtigte sowohl die statische als auch die dynamische Biofilmbildung in verschiedenen Entwicklungsstadien. Besonders bemerkenswert war, dass die induzierte Expression eines Gens in reifen Biofilmen eine schnelle Biofilmauflösung auslöste. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Repression bestimmter Gene nicht nur entbehrlich, sondern für eine geordnete Biofilmentwicklung notwendig ist. Insgesamt liefert diese Arbeit neue Erkenntnisse über das Abschalten von Genen, die die Biofilmbildung von V. cholerae unterstützen. Der zweite Teil des Projekts konzentrierte sich auf die Rolle bakterieller extrazellulärer Vesikel (BEVs) bei der Biofilmbildung. BEVs sind kugelförmige Strukturen, die kontinuierlich von der bakteriellen Oberfläche freigesetzt werden, deren biologische Funktion jedoch bislang nur unvollständig verstanden ist. Vergleichende proteomische Analysen von BEVs aus planktonischen Zellen und Biofilmen identifizierten ein bislang unbekanntes Außenmembranprotein, das stark in BEVs aus Biofilmen angereichert war. Dieses Protein verstärkte die Biofilmbildung in BEV-abhängiger Weise und wurde daher als außenmembranassoziiertes biofilmbildungsförderndes Protein A (ObfA) bezeichnet. Weitere molekulare Analysen identifizierten ObfA als negativen Modulator von HapR, einem zentralen transkriptionellen Regulator der Quorum-Sensing-Kaskade von V. cholerae, der die Biofilmbildung und Virulenz unterdrückt. Entsprechend zeigten obfA-Mutanten eine reduzierte Biofilmbildung sowie eine verminderte Kolonisationsfitness. Unerwarteterweise beeinflusst ObfA die HapR-Aktivität nicht über den kanonischen Quorum-Sensing-Signalweg, sondern über die Csr-Regulationskaskade. Zusammenfassend identifiziert diese Studie einen neuartigen, BEV-basierten intraspezifischen Kommunikationsmechanismus in V. cholerae, der die Biofilmbildung und Kolonisationsfitness über einen bislang unbekannten Regulationsweg steuert. Da ObfA-ähnliche Proteine auch in anderen Bakterien vorkommen, könnten diese Ergebnisse über V. cholerae hinaus von Bedeutung sein. Insgesamt trägt dieses Projekt wesentlich zum Verständnis der bakteriellen Biofilmbiologie bei und kann die Entwicklung neuer Strategien zur Prävention oder gezielten Auflösung von Biofilmen unterstützen.