Effiziente COL17A1 Genreparatur über CRISPR/Cas9n

Bis vor einigen Jahren galten genetische Erkrankungen als unheilbar. Die Entdeckung bakterieller Nukleasen, die in der Lage sind, DNA Sequenzen gezielt anzusteuern und zu schneiden, bildete den Grundstein zur Entwicklung von Technologien, die uns jetzt in die Lage versetzen, Erbschäden ex vivo zu korrigieren. Die Liste der genetischen Erkrankungen, für die Designer-Nukleasen gezielt als Gentherapie-Werkzeuge hergestellt werden wächst stetig. Genetische Erkrankungen der Haut s ind in mehrfacher Hinsicht besonders interessant für Designer-Nuklease-vermittelte Therapien: die Stammzellen der Haut sind gut zugänglich, sie lassen sich im Labor kultivieren und können wieder auf die Haut zurück transplantiert werden. Die schwere junktionale Form der Hauterkrankung Epidermolysis bullosa (JEB) beruht unter anderen auf Mutationen im COL17A1 Gen, die zum völligen Verlust von Kollagen XVII führen können. Die sehr seltene Erkrankung ist mit erheblichen Schmerzen verbunden, bedarf der 24/7 Pflege und ist unheilbar. Die Haut der betroffenen Patienten, die in Österreich wegen ihrer extrem empfindlichen Haut als Schmetterlingskinder bekannt sind, löst sich bereits bei geringster Beanspruchung ab. Unser Projekt umfasst die Entwicklung einer Designer-Nuklease-vermittelten Gentherapie für JEB bei der Krankheits-assoziierte Mutationen im COL17A1 Gen korrigiert werden sollen. Sicherheit und Effizienz stehen dabei im Vordergrund. Trotz der hohen Spezifität der Designer-Nukleasen ist bekannt, dass es bei ihrem Einsatz zu off-target Effekten kommen kann, wobei das Erbgut an unbeabsichtigten Stellen verletzt werden kann. Im Projekt soll daher eine potentiell spurenlose Genkorrektur über die als sehr sicher geltende Cas9 Mutante D10A initiiert werden. Die Cas9 Mutante D10A weist im Gegensatz zur Wildtyp Cas9 Nuklease eine reduzierte off-target Aktivität auf. Die Effizienz soll durch Verwendung von zwei Cas9 Mutanten, die nebeneinander an der Zielsequenz binden und schneiden, erhöht werden. Für die Reparatur der COL17A1 Mutation werden Designer-Nukleasen zusammen mit homologen Wildtyp-Sequenzen in Form eines DNA Oligonukleotids in Patientenzellen eingebracht. Diese Wildtyp-Gensequenzen werden dann im Zuge von DNA Reparaturvorgängen in den Zellen in das Zielgen eingebaut und somit die genetische Mutation korrigiert. In korrigierten Zellen wird die Expression von COL17A1 und die Produktion von Kollagen XVII über sqRT-PCR, Immunfluoreszenz und Western Blot Analysen überprüft werden. In Hautäquivalenten, die auf ein entsprechendes Mausmodell transplantiert werden, soll die Lokalisation von Kollagen XVII innerhalb der Basalmembranzone bestimmt werden. Neben der Analyse der Korrektur der COL17A1 Mutation in Patientenzellen, sollen Sicherheitsprofile der Applikation erstellt werden. Mögliche off-target Regionen sollen per Sequenzanalysen auf Modifikationen hin untersucht werden, um die Anwendbarkeit der Technologien für eine ex vivo Gentherapie für JEB evaluieren zu können.

Genetische Erkrankungen der Haut sind in mehrfacher Hinsicht besonders interessant für Designer-Nuklease-vermittelte Therapien: die Stammzellen der Haut sind gut zugänglich, sie lassen sich im Labor kultivieren und können wieder auf die Haut zurück transplantiert werden. Die junktionale Form der Hauterkrankung Epidermolysis bullosa (JEB) beruht unter anderen auf Mutationen im COL17A1 Gen, die zum völligen Verlust von Kollagen XVII führen können. Unser Projekt umfasste die Entwicklung einer Designer Nuklease-vermittelten Gentherapie für JEB bei der Krankheits-assoziierte Mutationen im COL17A1 Gen korrigiert werden sollen. Im Zuge des Projekts konnten wir verschiedene vielversprechende Geneditierungsstrategien für die spezifische COL17A1 Genkorrektur entwickeln. Die CRISPR Behandlung der JEB Zellen führte zur Herstellung normaler Mengen des Kollagen 17 Proteins. Ebenso wurde das Protein korrekt zwischen den Hautschichten einer künstlich hergestellten Haut abgelagert. Molekularbiologische Analysen ergaben, dass die Genschere zielsicher gearbeitet hat, und es zu keiner unerwünschten Veränderung der JEB Zellen kam. Der kontinuierliche Fortschritt in der CRISPR Gentherapie-Forschung gibt Hoffnung auf eine klinische Anwendung.