Analyse von STIM2-Domänen zur Aktivierung von CRAC-Kanälen

Ziel des vorliegenden Projektantrages ist die detaillierte Untersuchung und Analyse von STIM2 Domänen, welche an essentiellen Prozessen des CRAC Kanal Systems beteiligt sind. Verschiedene Mutanten von STIM und Orai Proteinen den Schlüsselproteinen des CRAC Kanal Komplexes führen zu pathophysiologischer Über bzw. Unterfunktion des zellulären Kalzium Einstrom Systems. Diese Mutanten resultieren in einer Vielzahl an Krankheiten und Symptomen wie eine erhöhte Anfälligkeit auf Infektionen, Autoimmunerkrankungen, das Stormorken Syndrom, die Muskelerkrankung Tubular aggregate myopathy (TAM) und der Blutkrankheit York platelet syndrome (YPS). In den vergangenen Jahren wurde das Hauptaugenmerk auf STIM1 und Orai1 gelegt, wobei das homologe Protein STIM2 nicht in äquivalenter Detailliertheit beschrieben wurde, was eine Wissenslücke darstellt. STIM2 ist Teil des CRAC Kanal Komplexes und daher wichtig für zelluläre (Überlebens-) Funktionen. Eine STIM2 Funktionsstörung würde sich somit auch auf den zellulären Kalzium Haushalt auswirken. Somit ist es unabdingbar das Wissen über STIM2 Domänen und deren regulatorische Funktionen zu erweitern. Experimentell werden hierfür humane Zellen (HEK293) verwendet, welche das zu untersuchende Protein exprimieren. Mit Hilfe von biophysikalischen Methoden wie Patch- Clamp und konfokale FRET Mikroskopie sowie molekularbiologischen und biochemischen Methoden werden diese Zellen analysiert. Erkenntnisse über die Struktur-Funktions Beziehung der STIM2 Domänen ermöglichen eine detaillierte Beschreibung des gesunden STIM2 Proteins sowie von pathophysiologisch relevanten STIM2 Mutanten.

Elucidation of regulatory STIM2 domains for CRAC channel activation Mag. Dr. Marc Fahrner Stromal Interaction Molecule (STIM) entspricht einer intrazellulären Proteinfamilie bestehend aus STIM1 und STIM2, wobei es sowohl von STIM1 als auch STIM2 verschiedene zelltypspezifische Isoformen gibt. Der allgemeine Aufbau dieser Proteine ist bei allen Isoformen gleich. STIM Proteine beinhalten einen ER luminalen N-terminalen Anteil, welcher als Kalziumsensor dient. (Das endoplasmatische Retikulum (ER) dient als intrazellulärer Kalziumspeicher, wobei eine Erniedrigung der ER luminalen Kalzium Konzentration das STIM Protein aktiviert). Im Anschluss an den ER luminalen Anteil besitzt STIM eine Transmembrandomäne und in weiterer Folge einen großen zytosolischen C-terminalen Teil. Dieser beinhaltet sogenannte coiled coil Domänen, welche funktionell und strukturell in den vergangenen Jahren gut beschrieben wurden, sowohl im ruhenden als auch aktiven STIM Protein. Aktiviertes STIM verändert seine Konformation sowie die zelluläre Lokalisation und kann dadurch in der Zellperipherie nahe der Plasmamembran den Kalzium-selektiven Kanal Orai, welcher in der Zellmembran sitzt, koppeln und aktivieren. Konsequenterweise strömt Kalzium entlang des elektrochemischen Gradienten vom extrazellulären Raum in das Zytosol der Zelle ein, um dort als Botenstoff (second messenger) zu agieren. Eine intrazelluläre Signalkaskade ist die Folge und letztendlich resultiert eine zelltypspezifische Antwort auf das initiale Signal, welches für die ER Kalziumspeicher Entleerung verantwortlich ist. Insgesamt werden STIM und Orai als jene Schlüsselproteine betrachtet, welche für den speicherabhängigen Kalziumeinstrom in eine Zelle hauptverantwortlich sind. Allgemein wird das System als "Store Operated Calcium Entry" (SOCE) System beschrieben. Da dieses SOCE System in der Mehrheit der humanen Zellen realisiert wird, resultieren STIM- sowie Orai- Mutanten in diversen Krankheiten, je nachdem ob die genetisch kodierte Mutation in STIM oder Orai einen aktivierenden Effekt (gain of function) oder inaktivierenden Effekt (loss of function) zur Folge hat. Die Krankheiten umfassen schwere Immundefizienz (SCID), das Stormorken Syndrom, Tubuläre Aggregat Myopathie, das York Platelet Syndrom und noch mehr. Dabei kann der Krankheitsverlauf von mild bis letal verlaufen. Allgemein ist es von Vorteil den STIM Aktivierungs- / Inaktivierungs- Mechanismus auf molekularer Ebene zu verstehen. Dies wurde im Kontext des physiologischen "wild type" als auch des pathophysiologischen Systems im Zuge des Projekts untersucht. Vor allem die Stormorken Syndrom induzierende STIM1 R304W Variante stand bei manchen unserer projektrelevanten Publikationen im Fokus. Dank der Forschung auf molekularer Ebene steigen die Chancen auf Therapiemöglichkeiten im Kontext der molekularen Medizin. Im vorliegenden Projekt haben wir die Struktur - Funktionsbeziehung von STIM1 auf molekularer Ebene intensiv untersucht und konnten die Ergebnisse in 9 wissenschaftlichen Publikationen darstellen. Meilensteine, welche in STIM1 erreicht wurden, sollen auf STIM2 angewendet werden, um auch diese STIM Variante auf molekularer Ebene zu charakterisieren.