Substraterkennung und Prozessierung der AAA-ATPase Drg1

Die evolutionär hochkonservierte Protein-Familie der AAA-ATPasen transformiert chemische Energie durch ATP Hydrolyse in mechanische Kraft um damit Substratproteine umzufalten oder zu entfalten. Der exakte Mechanismus wie AAA-ATPasen ihre Substrate erkennen und prozessieren und wie bei der Substraterkennung die ATP Hydrolyse in den AAA-domänen aktiviert wird, ist jedoch bisher noch nicht gut verstanden. Deshalb beleuchtet dieses Projekt den Substraterkennungs- und Prozessierungs- Mechanismus der AAA-ATPase Drg1, die mit der Ablösung von Rlp24 von prä-ribosomalen Partikeln eine essentielle Funktion in der Ribosomenbiogenese der Bäckerhefe ausübt. Aufgrund seiner exklusiven Spezifität für Rlp24 stellt Drg1 ein exzellentes Modellsystem für detaillierte biochemische und strukturbiologische Untersuchungen zur Substratprozessierung dar. Die Ergebnisse werden einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des grundlegenden Funktionsmechanismus von AAA-ATPasen leisten. Weiters wird dieses Projekt die Funktion des humanen Orthologen von Drg1, dem SPATA5 Protein, untersuchen, um festzustellen ob die Funktion der AAA-ATPase in der Ribosomenbiogenese im Menschen konserviert ist. Vor kurzem wurde entdeckt, dass Mutationen in SPATA5 zu schweren Entwicklungsstörungen und neurologischen Defekten führen. Es ist jedoch nicht bekannt, wie diese Mutationen zur Ausprägung der Symptome der Krankheit führen. Interessanterweise liegen die Mutationen größtenteils in Regionen, die zwischen Mensch und Hefe hoch konserviert sind. Die geplanten Untersuchungen bilden einen neuen Ansatz um zu verstehen wie sich diese homo- und heterozygoten Mutationen auf die enzymatischen Eigenschaften des SPATA5 Proteins auswirken und wie sie sich gegenseitig beeinflussen. Dazu werden wir eine Kombination aus verschiedenen biochemischen und genetischen Ansätzen verfolgen. Gemeinsam werden uns diese Analysen ein detailliertes Verständnis liefern, wie die einzelnen Mutationen im SPATA5 Gen zur Ausprägung des pathologischen Phänotyps führen.

Ribosomen synthetisieren die Proteine in der Zelle und sind deshalb absolut essentiell. Sie bestehen aus einer kleinen und einer großen Untereinheit, die jeweils aus ribosomaler RNA und ribosomalen Proteinen aufgebaut sind. Die Bildung der Ribosomen ist der energieaufwändigste Prozess in der Zelle und deshalb eng mit dem Zellwachstum und der Zellteilung koordiniert. Die Bildung der reifen Ribosomen erfolgt in vielen aufeinanderfolgenden Schritten, die in der Bäckerhefe von mehr als 300 Reifungsfaktoren durchgeführt werden. Diese Reifungsfaktoren binden in einer strikten Reihenfolge an die Ribosomenvorläufer und müssen nach den von Ihnen durchgeführten Reaktionen wieder abgelöst werden, um ein Fortschreiten der Reifung zu ermöglichen. Die meisten dieser Reifungsfaktoren wirken bereits im Nukleolus oder im Nukleoplasma, doch einige, sogenannte "shuttling Faktoren", begleiten die Ribosomenvorläufer bis in das Zytoplasma, wo sie abgelöst und recycelt werden müssen. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass die AAA-ATPase Drg1 unmittelbar nach dem Kernexport an den Vorläufer der großen ribosomalen Untereinheit bindet und für die Ablösung von solchen "shuttling Faktoren" essentiell ist. In diesem Projekt konnten wir den Ablösemechanismus detailliert aufklären. Mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie konnten wir die Struktur der AAA-ATPase im Komplex mit dem Ribosomenvorläufer bestimmen. Drg1 besteht dabei aus einer N-terminalen Domäne sowie zwei aufeinanderfolgenden ATPase Domänen und bildet ein ringförmiges Hexamer aus. Dieses assoziiert mit seinen N-terminalen Domänen im Bereich des "polypeptide exit tunnels" an den Ribosomenvorläufer und bindet die C-terminalen Reste des Reifungsfaktors Rlp24 in die zentrale Öffnung des Hexamers. Die in diesem Bereich der AAA-ATPase vorhandenen aromatischen Aminosäurereste greifen dabei sukzessive unter ATP Verbrauch die Peptidkette von Rlp24 und ziehen es damit vom Ribosomenvorläufer. Aufgrund der Strukturaufklärung mehrerer Zwischenstufen konnten wir den Mechanismus der Substratprozessierung detailliert aufklären. Die Ablösung von Rlp24 ist die Voraussetzung für die Ablösung und das Recycling aller anderen "shuttling Faktoren" sowie für alle zytoplasmatischen Reifungsschritte. Eine Hemmung des Prozesses durch den Wirkstoff Diazaborin ist daher fatal für die Zelle. In diesem Projekt konnten wir auch die Struktur von Drg1 mit dem Inhibitor aufklären und zeigen, dass Diazaborin spezifisch in die zweite ATPase Domäne von Drg1 bindet und mit dem dort gebundenen Nukleotid ein kovalentes Addukt ausbildet. Dieses Addukt verhindert die Ablösung des Nukleotids und führt so zu einer markanten Versteifung und Inaktivierung der zweiten ATPase Domäne. Dieses Beispiel zeigt, wie wichtig niedermolekulare Substanzen für die Aufklärung der Abläufe im Zuge der Ribosomenreifung sind und welch großes Potential Inhibitoren der Ribosomenbiogenese auch für die medizinische Forschung besitzen. Tatsächlich konnten wir kürzlich in weiterführenden Studien zeigen, dass die aus Flechten isolierte Usninsäure frühe Schritte der Ribosomenbiogenese hemmt. Da die Bildung neuer Ribosomen besonders für sich schnell teilende Zellen wichtig ist, könnte dieser Befund die bekannte anti-Tumor Aktivität der Usninsäure erklären.