Enzymatischer Abbau methylierter Glykane im Stoffwechsel

Forschungskontext: Die Methylierung von Biomolkülen ist in viele zelluläre Regulationsprozesse involivert. Für Proteine und DNA-Moleküle sind bereits einige diesbezügliche Auf- bzw. Abbauwege bekannt. Allerdings wurden Methylgruppen auch auf Kohlenhydratstrukturen gefunden und für diese gibt es noch keine Informationen bezüglich Biosynthese oder Abbau. Kohlenhydratstrukturen spielen eine wichtige Rolle bei Erkennungsprozessen. Eine Modifikation der einzelnen Zuckereinheiten verändert die Spezifität von Erkennungs- und Bindungsvorgängen. Hypothesen/Ziele: Im vorliegenden Projekt möchten wir den Abbau von methylierten Glykanstrukturen untersuchen. Jene Organismen, die in der Lage sind solche Strukturen zu (bio)synthetisieren, müssen auch einen entsprechenden Mechanismus für deren Abbau aufweisen. In Schneckengeweben wurden Methylgruppen an protein-gebundenen Glykanstrukturen nachgewiesen. Daher werden in diesen Organismen auch Enzyme erwartet, die diese Strukturen metabolisch abbauen können. Ansatz/Methoden: Eine solche Demethylierungs-Enzymaktivität wird im Rahmen des Projekts mittels nativen und synthetischen Substraten in Schneckenorganellen nachgewiesen. Danach werden Proteine, die die entsprechende Enzymaktivität aufweisen, gereinigt, sequenziert, kloniert und exprimiert. Sowohl das native als auch das rekombinante Protein werden auf ihre biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften untersucht. Die Substratspezifitäten werden mit verschiedenen nativen Substraten und anderen methylierten Molekülen ermittelt um einen Überblick für potentielle Anwendungen zu erhalten. Mittels der Aminosäuresequenz wird in Datenbanken nach homologen Proteinen anderer Organismen, die bekannterweise auch methylierte Zuckerketten aufweisen (andere Mollusken und Parasiten), gesucht.

Glykosylierung modifiziert die Eigenschaften von Proteinen und Lipiden. Glykane tragen damit nicht nur zur Veränderung von physikalischen Eigenschaften wie Konformation, Proteaseresistenz, Ladung oder Hydrophobizität bei, sondern modulieren auch verschiedene Arten von Erkennungsprozessen, in der Reproduktionsbiologie, der Selbst-/Nicht-Selbst-Erkennung, der Zell-Zell-Kommunikation, dem Transport innerhalb der Zelle, bei der Entwicklung, der Differenzierung, der Wirt-Pathogen- oder Wirt-Symbionten-Interaktion, der Immunaktivierung, dem Zelltod und sogar in der Evolution. Die Biosynthese dieser Glykane ist ein komplexer posttranslationaler Vorgang, an dem eine Reihe spezifischer Glykosidasen und Glykosyltransferasen beteiligt ist. Die jeweiligen spezifischen Modifikationen hängen von der Art des Organismus und seinem Entwicklungs- und Gesundheitszustand ab. Mollusca (Weichtiere) ist ein großes und evolutionär sehr erfolgreiches Phylum, das weltweit Süßwasser-, Meeres- und Landlebensräume bevölkert. Einige Arten sind als wichtige Mitglieder verschiedener Ökosysteme im Hinblick auf Abfallbeseitigung und Reinigung erkannt, andere werden aufgrund ihres Nährwerts und ihrer Schalen verwendet. Vor allem Gehäuseschnecken und Nacktschnecken sind allerdings als Schädlinge in der Landwirtschaft oder als Wirte von Parasiten bekannt. Ihre erfolgreiche Besiedlung von verschiedenen Habitaten, ihre Anpassungsfähigkeit an wechselnde Umweltbedingungen und ihr immenses Potenzial für medizinische und pharmazeutische Anwendungen machen Mollusken zu einem interessanten Forschungsobjekt. Doch trotz ihrer Bedeutung mangelt es derzeit noch an Informationen über ihre biochemischen oder molekularbiologischen Eigenschaften und Fähigkeiten. Die Glykanspektren von Mollusken weisen eine Reihe von Besonderheiten auf, die in dieser Form bei Wirbeltieren nicht vorkommen. Ziel des Projekts war es nun, Enzyme zu identifizieren, die diese Modifikationen verursachen. In diesem Projekt konnten wir mehrere Glykosidasen und Glykosyltransferasen identifizieren, klonieren, exprimieren und charakterisieren, die am Aufbau und an der Modifikation von N- und O-Glykanen von Mollusken beteiligt sind: -Galaktosidasen aus Arion lusitanicus, Arion vulgaris und Crassostrea gigas, eine UDP-N-Acetylglucosamin: -1,3-D-Mannosid--1,2-N-Acetylglucosaminyltransferase I aus Crassostrea gigas, UDP-Gal:Glykoprotein-N-Acetylgalactosamin--1,3-Galactosyltransferasen (T-Synthasen) aus Biomphalaria glabrata, Pomacea canaliculata und Crassostrea gigas und eine -1,2-Fucosyltransferase aus Crassostrea gigas. Abgesehen von der Fucosyltransferase wurden alle diese Glykoenzyme im Rahmen dieses Projekts zum ersten Mal in Mollusken beschrieben. Alle Enzyme wurden durch Homologiesuche oder Reinigung aus natürlichen Quellen identifiziert, kloniert, in einem Insektenzell-Expressionssystem exprimiert, teilweise gereinigt und hinsichtlich ihrer biochemischen Parameter, Substratspezifitäten und dreidimensionalen Strukturmerkmale charakterisiert. Mehrere der angewandten Methoden mussten an die Bedürfnisse der Molluskenenzyme angepasst werden, um Erfolg zu haben. Selbst wenn die Enzyme eine gewisse Proteinsequenzhomologie mit bereits bekannten Enzymen anderer Arten aufweisen, zeigen einige von ihnen völlig unterschiedliche Merkmale in Bezug auf ihre strukturelle Organisation, biochemischen Eigenschaften und Substratspezifitäten. Dies bestätigt, dass Mollusken ein enormes Potenzial für die Entwicklung neuartiger spezifischer Glykane haben, die medizinische Anwendungen verbessern könnten.