GMC Oxidoreduktasen: Common ancestors

Die Glucose-Methanol-Cholin (GMC)-Superfamilie der FAD-abhängigen Oxidoreduktasen umfasst eine Reihe von Oxidasen und Dehydrogenasen, die auf verschiedene Substrate wie Zucker oder Alkoh ole einwirken. Diese große Familie von Oxidoreduktasen ist durch eine gemeinsame Faltung und eine enge phylogenetische Beziehung definiert und umfasst industriell relevante Enzyme wie Arylalkohol-Oxidasen (AAO) und Pyranose-Dehydrogenasen (PDH), die eine Gruppe dieser Familie bilden, oder Glucose-Oxidasen (GOx) sowie Glucose-Dehydrogenasen (GDH), die eine weitere GMC-Klade bilden. Diese Enzyme sind unter anderem für den Abbau von Lignocellulose von Bedeutung, da sie die Ausbeute an fermentierbaren Zuckern erhöhen können, die durch enzymatische Hydrolyse erhalten werden können. Durch Anwendung der Methode der Rekonstruktion von anzestralen Genesequenzen wollen wir ein besseres Verständnis dafür erlangen, wie sich diese Enzyme im Laufe der Zeit entwickelt haben. Darüber hinaus streben wir die Identifizierung von Enzymen an, die eine höhere Thermostabilität aufweisen und für verschiedene Anwendungen interessant sind.

Die Klade der Pyranose-Oxidasen (POx) ist ein entfernter Zweig in der Familie der Oxidoreduktasen der AA3-Familie, und bakterielle Vertreter wurden in der Vergangenheit kaum untersucht. Wir konnten zeigen, dass der Sequenzraum von bakteriellen Pyranose-Oxidasen zwei verschiedene Aktivitäten enthält, die POx-ähnliche Aktivität (Oxidation von Monosacchariden) und die C-Glykosid-3-Oxidase-Aktivität (CGOx; Oxidation des Glukoseanteils in C- und O-Glykosiden). Diese Glykoside kommen häufig in Pflanzen vor und spielen eine wichtige Rolle für die menschliche Ernährung und Gesundheit, daher ist es wichtig, über ihren Metabolismus Bescheid zu wissen. Durch die genauere Untersuchung dieses Sequenzraums konnten wir zeigen, dass aktinobakterielle Sequenzen 4 unterschiedliche Kladen bilden, von denen eine (dimere) POx-Aktivitäten enthält, zwei monomere CGOx-Aktivitäten enthälen, und eine noch nicht untersucht ist. Anschließend verwendeten wir die Rekonstruktion der Sequenz von Vorfahren, um die Verschiebung einer vermuteten ursprünglichen (C-Glykosid) 3-Oxidase zu rezententen Monosaccharid-oxidierenden POx und bakteriellem CGOx zu verfolgen. Wir konnten so eine Verschiebung vom ältesten Vorfahren, der ein Generalist war, zu den verschiedenen spezifischen Aktivitäten in einzelnen Kladen während der Evolution zeigen. Strukturmodelle der Vorfahren bestätigten eine mögliche Änderung der Substratpräferenzen auf der Grundlage der Unterschiede in Regionen, die die Substratbindung im aktiven Zentrum steuern und abstimmen - Substratschleife, Flavinylierungsmotiv oder Reste, die mit dem Substrat interagieren, sowie Oligomerisierung. Basierend auf der Hypothese, dass die Oligomerisierung die Substratpräferenz beeinflusst, haben wir eine dimeres Monosaccharid-spezifisches POx zu einem Monomer entwickelt, das tatsächlich eine signifikant erhöhte Aktivität mit C-Glykosiden und eine verringerte Aktivität mit Monosacchariden zeigte. Darüber hinaus untersuchten wir den Sequenzraum von Glukose-Oxidasen und Glukose-Dehydrogenasen der AA3 Familie. Wir konnten Enzyme identifizieren, die bevorzugt Oligosaccharide wie Maltose oxidieren. Diese könnten für Anwendungen in Maltose-spezifischen Biosensoren interessant sein.