Herstellung von Diffusionsbarrieren in der Plasmamembran

Jede Zelle wird von einer Plasma-Membran eingehüllt. Diese Membran erfüllt eine große Zahl von für die Zelle essentiellen Aufgaben, darunter den Schutz vor unerwünschtem Einstrom von gefährlichen Substanzen, aber auch umgekehrt die gezielte Aufnahme von gewünschten Substanzen. Eine Lipid-Doppelschicht stellt das zentrale Gerüst der meisten Plasma-Membranen dar. Dabei handelt es sich um eine extrem dünne, für viele Substanzen undurchdringliche Schicht, welche dennoch erstaunlich dynamisch und fluide ist. In diese Lipidschicht eingebettet sind Hunderte verschiedener Proteinsorten, so zum Beispiel jene Proteine, welche hochselektiv bestimmte Substanzen von außen nach innen transportieren. In unserem Projekt versuchen wir, ein solches Transporter-Protein besser zu verstehen, nämlich den Transporter für Serotonin. Serotonin ist ein Neurotransmitter, also ein Botenstoff, der für die Signalübertragung zwischen Nervenzellen wichtig ist. Nach der Serotonin-Ausschüttung in die Umgebung der Nervenzelle wird an nahgelegenen Nervenzellen ein Signal ausgelöst. Zur Beendigung des Signalisierungs-Prozesses ist es also notwendig, Serotonin wieder aus der Umgebung der Nervenzelle zu entfernen und für weitere Ausschüttungen zur Verfügung zu stellen. Um diesen Aufnahme-Prozess effizient zu betreiben, erscheint es wichtig, den Serotonin-Transporter nicht gleichmäßig über die Nervenzellen zu verteilen sondern an jenen Stellen zu platzieren, an denen eine Wiederaufnahme des Neurotransmitters sinnvoll ist. In unserem Projekt widmen wir uns daher zwei Fragestellungen: Wie ist die räumliche Anordnung des Serotonin-Transporters in der Plasmamembran von Nervenzellen? Zur Beantwortung dieser Frage werden wir neuartige Mikroskopie-Methoden einsetzen, die es ermöglichen, mittels einzelmolekularer Lokalisierung weit unterhalb der klassischen optischen Auflösungsgrenze die Verteilung des Proteins zu bestimmen. Spielt die Größe des Proteins für die räumliche Anordnung eine Rolle? Dieser Frage zugrunde liegt ein Resultat aus unseren gemeinsamen Vorarbeiten, welches zeigte, dass der Serotonin-Transporter in der Regel ein Gebilde aus mehreren Proteinen ist, und sich als sogenanntes Serotonin-Transporter-Oligomer in der Plasmamembran bewegt. Je nach Größe dieses Oligomers ändert sich die Mobilität, sodass sich große Protein-Komplexe langsamer bewegen als kleine. Dieser Unterschied wird massiv verstärkt, sobald unbewegliche Hindernisse in der Plasmamembran eingebaut sind. Unsere Vermutung ist nun, dass Nervenzellen an bestimmten Stellen unbewegliche Hindernisse in die Plasmamembran einbauen, um so den Transporter dort in seiner Beweglichkeit quasi einzufrieren. Um dies zu testen, werden wir ein halbsynthetisches Testsystem etablieren, welches uns erlaubt, immobile Hindernisse in der Plasmamembran gezielt einzubauen und die Auswirkung auf die Bewegung des Serotonin-Transporters zu bestimmen.

Transporterproteine sind eine Klasse von Proteinen, die den Transport von Ionen und/oder Molekülen durch die Zellmembran ermöglichen. Es gibt verschiedene Unterklassen von Transportern. Neurotransmittertransporter für Monoamine, darunter Serotonin, gehören zur Familie der Solute Carrier 6-Transporter, die den elektrochemischen Gradienten von Natrium für den Transport der Monoamine nutzen. Diese Transporter befinden sich hauptsächlich perisynaptisch im präsynaptischen Neuron. In diesem Projekt untersuchten wir das Verhalten des Serotonin-Transporters (SERT). Dieses Protein reguliert die Funktion von Serotonin, das umgangssprachlich als Glückshormon bezeichnet wird. Der Serotonin-Transporter erfüllt eine entscheidende Funktion in unserem Nervensystem: Es ist für die Wiederaufnahme von Serotonin und damit für die Termination der Signalweiterleitung verantwortlich. Eine Dysregulation von dem Serotonin-Transporter wird mit verschiedenen psychischen Störungen wie Depressionen und Zwangsstörungen in Verbindung gebracht. Der Serotonin-Transporter ist auch das pharmakologische Ziel vieler medizinisch zugelassener Medikamente und Partydrogen. Trotz seiner klinischen Bedeutung ist nur wenig über die Mechanismen bekannt, die den Aufbau und die Funktion des Serotonin-Transporters steuern. Das Verständnis seines zugrunde liegenden molekularen Verhaltens, einschließlich seiner Bewegung und Organisation, könnte die Entwicklung besserer Behandlungsansätze ermöglichen. Bislang gab es nur begrenzte Möglichkeiten, den Transporter in der Mikroskopie selektiv sichtbar zu machen. Die meisten Markierungsmethoden waren nicht ausschließlich auf den Serotonin-Transporter beschränkt oder stellten andere Herausforderungen für fortgeschrittene Mikroskopietechniken dar. Daher haben wir eine Version des Serotonin-Transporters mit einer kurzen Tag-Sequenz entwickelt, die eine spezifische Markierung mit benutzerdefinierten Fluorophoren ermöglicht. Damit eignet er sich ideal für eine Vielzahl von Mikroskopiemethoden. Wir haben festgestellt, dass die entwickelte Transporterversion ihre Funktionalität und ihr hochgradiges Oligomerisationsverhalten beibehält. Um die Organisation des Transporters genauer zu untersuchen, führten wir sogenannte Superresolution-Experimente durch, die eine Visualisierung im Nanobereich ermöglichen. Unser Interesse galt insbesondere der Beziehung zu den zugrunde liegenden Zellstrukturen, von denen bekannt ist, dass sie sich in einem periodischen Muster anordnen. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Bewegung des Serotonin-Transporters durch diese Strukturen beeinflusst werden könnte. Es handelt sich um ein relativ großes Molekül, von dem darüber hinaus bekannt ist, dass es Strukturen höherer Ordnung bildet. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich der Serotonin-Transporter in einer periodischen Weise anordnet, die mit der zugrunde liegenden Zellstruktur in Zusammenhang stehen könnte.