Transkriptionsfaktor Netwerke in Formativer Pluripotenz

Der Übergang von einem zellulären Entwicklungsstatus in den nächsten kennzeichnet die Embryonalentwicklung. Jeder einzelne Übergang geht einher mit Veränderungen in der Gen Expression: Gene, die spezifisch für den Ausgangsstatus sind, müssen abgestellt werden, während Gene, die wichtig sind für den nächsten Entwicklungsstatus, müssen aktiviert werden. Wann welche Gene aktiv sind, wird von einem Netzwerk von Transkriptionsfaktoren festgelegt, dass wiederum spezifisch ist für jedes einzelne Entwicklungsstadium. Das Netzwerk von Transkriptionsfaktoren wichtig für den Status von Maus Embryonalen Stammzellen wurde in großem Detail charakterisiert und wir verstehen viele der Interaktionen zwischen den wichtigsten regulatorischen Faktoren. Sobald aber die Differenzierung dieser embryonalen Stammzellen in die Formative Pluripotenz, den nächsten Entwicklungsschritt, eingeleitet wird, wird ein neues und so weit nur rudimentär verstandenes Netzwerk an Transkriptionsfaktoren etabliert. Wir haben vor einiger Zeit den Transkriptionsfaktor Otx2 als einen Faktor identifiziert, der an der Etablierung der Formativen Pluripotenz mitwirkt. Interessanterweise führt der Verlust von Otx2 nicht zu einem Defekt in der Differenzierung. Dies bedeutet, dass es andere, soweit noch unbekannte Faktoren gibt, die redundant sind zu Otx2. Um diese Faktoren zu identifizieren, werden wir einen genom- weiten, auf CRISPR-Cas9 basierenden Screen durchführen. Dabei werden wir fluoreszierende Reporter verwenden, die sowohl das Verlassen des embryonalen Stammzellstatus als auch das Eintreten in die Formative Pluripotenz markieren. Wir werden diesen Screen sowohl in normalen als auch in Zellen durchführen, die defizient sind in Otx2. Unsere Hypothese ist, dass gerade diese Zellen mehr sensitive sind für den Verlust von weiteren Faktoren und es uns erlauben, die Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die Redundanz zu Otx2 aufweisen. Im Weiteren werden wir die Kandidaten des Screens charakterisieren und analysieren, wie die einzelnen Faktoren mit Otx2 interagieren. Im zweiten Teil des Projektes werden wir analysieren, wie der Verlust eines einzelnen Faktors sich auf die Differenzierung einzelner Zellen auswirkt. Zwar verhindert der Verlust von Otx2 nicht die Differenzierung, aber es ist unklar, ob sich die Zellen ganz genau gleich verhalten. Folgen diese Zellen der genau gleichen Abfolge von Schritten in ihrer Differenzierung oder gibt es ein neues Stadium, der in normalen Zellen nicht auftritt? Um diese Frage zu beantworten werden wir eine neue Art des Multiplexens von mehreren Zelllinien und Zeitpunkten in einem single cell RNA Sequenzierungsexperiments verwenden. Zusammen mit den neuesten Entwicklungen in der Analyse dieser Daten werden wir diesen ersten Differenzierungsschritt von embryonalen Stammzellen genauestens untersuchen.

Während der Entwicklung durchlaufen Zellen zahlreiche zelluläre Entwicklungsstadien. Bei jedem Übergang ändern die differenzierenden Zellen ihr Genexpressionsprofil als Reaktion auf einen Reiz von aussen und nehmen dadurch eine neue zelluläre Identität an. Ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren induziert das korrekte Genexpressionsprofil jedes Entwicklungsstadium, aber bei jedem Übergang muss das Netzwerk der Transkriptionsfaktoren neu aufgestellt und verändert werden. Einige Faktoren werden inaktiviert, andere werden neu in das System integriert und dadurch werden Veränderungen der Genexpression initiiert. Jeder Entwicklungschritt ist durch ein spezifisches Netzwerk von Transkriptionsfaktoren gekennzeichnet, und das Verständnis der Natur eines solchen Netzwerks ist eine der Kernfragen der Entwicklungsbiologie und Transkriptionsregulation. Mit der geförderten Arbeit wollten wir die Hauptakteure eines zellulären Zustands identifizieren: des formativen pluripotenten Stammzellzustands. Maus embryonale Stammzellen, oft als naive pluripotente Stammzellen bezeichnet, gehören zu den am besten charakterisierten zellulären Entwicklungstadien, und ihr Transkriptionsfaktornetzwerk wurde eingehend untersucht. Sobald die Zellen jedoch mit der Differenzierung beginnen, verlassen die Zellen den naiven pluripotenten Zustand und treten in den formativen pluripotenten Zustand ein. Während der formative pluripotente Zustand viele der wichtigsten Transkriptionsfaktoren mit dem naiven Zustand teilt, werden viele der naiven spezifischen Transkriptionsfaktoren herunterreguliert und möglicherweise durch andere, unbekannte Faktoren ersetzt. Die Natur dieser Faktoren und ihr Zusammenspiel mit gemeinsamen Transkriptionsfaktoren ist jedoch unklar. Daher wird die Untersuchung des formativen Transkriptionsfaktornetzwerks uns helfen zu verstehen, wie Zellen von einem Zellzustand in einen anderen übergehen, der ein eng verwandter Zellzustand ist. In diesem Projekt führten wir ein genomisches Screening durch, um wichtige Transkriptionsfaktoren für den formativen pluripotenten Zustand zu identifizieren. Obwohl wir noch keine neuen Schlüsselakteure identifiziert haben, konnten wir eine neue und unerwartete antivirale Reaktion des formativen Entwicklungsstatus charakterisieren, die während des Übergangs vom naiven zum formativen Zustand aktiviert wird. Diese Aktivierung erfolgt nicht über die Signalwege, die Virusinfektionen überwachen, sondern über das Pluripotenznetzwerk selbst. Wir schlagen daher ein neuartiges Modell vor, bei dem sich der sich entwickelnde Embryo durch die präventive Aktivierung eines antiviralen Zustands vor einer Virusinfektion schützt. Diese Studie identifizierte zahlreiche weitere Kandidaten, die für den Einstieg in die formative Pluripotenz wichtig sein könnten und derzeit weiter untersucht werden. Darüber hinaus trugen unsere Daten zur Entwicklung eines neuartigen Softwaretools bei, das Veränderungen im Netzwerk der Transkriptionsfaktoren bei Verlust wichtiger Komponenten vorhersagen kann.