Auf der Suche nach einem DNA-translatierenden Ribosom.

Der Bauplan jeder Zelle liegt als DNA vor. Für die Proteinsynthese müssen bestimmte Gene auf der DNA in RNA transkribiert werden, welche dann an spezialisierte Maschinen in der Zelle - die Ribosomen übergeben werden. Dort wird die sogenannte Messenger-RNA (mRNA) in eine Abfolge von Aminosäuren, dem Protein, übersetzt. Der Fluss der genetischen Information von DNA über RNA zum Protein wurde bereits 1958 von Francis Crick beschrieben. Ziel dieses Projekts ist es, eine Abkürzung innerhalb dieses zentralen Dogmas der Molekularbiologie zu finden, damit die Ribosomen eine DNA anstelle einer RNA als Träger der genetischen Information übersetzen können. Erste Spekulationen über die Möglichkeit, DNA als Übersetzungsvorlage zu verwenden, kamen aus Studien in den 1960er Jahren. Es wurde beobachtet, dass unter bestimmten Bedingungen, wie der Anwesenheit von fehlerinduzierenden Antibiotika, einzelsträngige DNA für die Proteinsynthese akzeptiert wurde. Die Bindungsstelle dieser Antibiotika ist die 16S ribosomale RNA, die für den Dekodierungsprozess der mRNA während der Translation verantwortlich ist. Weiters wurde beobachtet, dass sogenannte Transfer-RNAs (tRNAs), die Aminosäuren zum Ribosom bringen, nicht so effizient an den Ribosom-mRNA-Komplex binden können. Dieses Bindungsdefizit konnte aber durch Zugabe von fehlerinduzierenden Antibiotika behoben werden. Da auch Mutationen in ribosomaler RNA und ribosomalen Proteinen zu falsch eingebauten Aminosäuren bei der Translation führen können, zielt dieses Projekt darauf ab, mutierte Ribosomen zu erzeugen, die fähig sind, eine mRNA mit einem DNA- Codon korrekt in ein Protein zu übersetzen. Die eingebauten Mutationen innerhalb der 16S rRNA werden entweder vollständig randomisiert sein oder auf essentielle Regionen, die direkt an der Dekodierung oder Bindung von Aminoacyl-tRNAs beteiligt sind, fokussiert sein. Durch Anwendung eines bestimmten Selektionssystems können mutierte Ribosomen, die fähig sind, das DNA-Codon zu translatieren, von den Partikeln getrennt werden, die das DNA Codon nicht lesen können und so während der Proteinsynthese hängen bleiben. Innerhalb eines Pools von Millionen potenzieller ribosomaler Mutationen können mit dieser Methode diejenigen gefischt, identifiziert und weiter charakterisiert werden, die den ersten Schritt zur Abkürzung des zentralen Dogmas der Molekularbiologie erfolgreich gemeistert haben.

Jede lebende Zelle besitzt ein Genom, das aus DNA besteht. Für die Proteinsynthese müssen die benötigten Gene von der DNA in RNA umgeschrieben und diese dann an spezielle "Maschinen" in der Zelle, den Ribosomen, weitergegeben werden. Dort wird die Boten-RNA (mRNA) in ein Protein, d. h. eine Abfolge von Aminosäuren, übersetzt. Dieser Fluss der genetischen Information von der DNA über die RNA zum Protein wurde bereits 1958 von Francis Crick beschrieben. Ziel des Projekts ist es, zu untersuchen ob dieser Prozess abgekürzt werden kann, indem Ribosomen erzeugt werden, die DNA direkt lesen und in Proteine übersetzen können. Erste Spekulationen über die Möglichkeit, die DNA als Vorlage für die Proteinsynthese zu verwenden, stammen aus Studien in den 1960er Jahren. Es wurde beobachtet, dass unter bestimmten Bedingungen, wie z. B. bei Anwesenheit von Antibiotika, die zu Übersetzungsfehlern führen, einzelsträngige DNA für die Proteinsynthese akzeptiert wird. Späterer Studien zeigten, dass Transfer-RNAs (tRNAs), die für die Lieferung der Aminosäuren zuständig sind, nicht so effizient an ein DNA-Codon im Ribosom binden können. Diesen Bindungsdefekt konnte wiederum durch bestimmte Antibiotika behoben werden. Da auch Mutationen in der ribosomalen RNA und in den ribosomalen Proteinen zu Fehlern in der Proteinsynthese führen und möglicherweise die Bindung der tRNA während der Übersetzung verändern können, zielt dieses Projekt darauf ab, mutierte Ribosomen zu finden, die DNA als Vorlage für Proteinsynthese verwenden können. In diesem Projekt wurden verschiedene Strategien getestet und etabliert, um Ribosomen, die DNA in Proteine übersetzten können, von solchen zu trennen, die dazu nicht in der Lage sind. Dazu wurden verschiedene Selektionsprotokolle basierend auf Non-Stop-mRNAs, Stalling-Sequenzen oder dem Weglassen essentieller Proteine getestet und etabliert. Gleichzeitig wurden Expressionsbibliotheken von Ribosomen erstellt, die zufällige Mutationen in der gesamten 16S rRNA enthielten. In einer zweiten Expressionsbibliothek wurden nur die Bereiche der 16S rRNA zufällig mutiert, die bereits direkt mit der Dekodierung in Verbindung gebracht wurden. Ziel war es, einen Pool and mutierten Ribosomen zu erhalten, von denen einige in der Lage sind, DNA zu decodieren. Um vielversprechende mutierte Ribosomen während des Selektionsprozesses zu verfolgen und zu identifizieren, wurde ein sensibles Nanopore-Sequenzierungsprotokoll für isolierte 16S rRNA am Institut etabliert. Am Ende der Förderphase konnten ein Selektionszyklus durchgeführt werden, der aber unter den getesteten Bedingungen nicht erfolgreich war. Obwohl, die Förderphase dieses Projektes beendet ist, werden die Arbeiten fortgesetzt, um letztendlich die Frage beantworten zu können, ob Ribosomen auch einzelsträngige DNA translatieren können. Auch wenn das endgültige Ziel noch nicht erreicht ist, haben unsere Bemühungen im Rahmen dieses Projekts zu interessanten Folgeprojekten und Publikationen geführt, die auf den in diesem Projekt entwickelten Tools und Erkenntnissen aufbauen.