Protein Design des aktiven Zentrums kofaktor-freier Enzyme

Enzyme sind die Katalysatoren der Natur. Aufgrund ihrer schonenden Reaktionsbedingungen und ihrer hohen Selektivität sind sie wichtige Werkzeuge für die organische Synthese. Das begrenzte Substratspektrum vieler Biokatalysatoren erfordert jedoch Methoden zur Modifikation von Enzymmechanismen und Einführung neuer Reaktivitäten. Insbesondere Reaktionen zur Bildung und Brechung von Bindungen zwischen Kohlenstoffatomen sind hier für synthetische Reaktionen von hohem Interesse, biokatalytisch jedoch sehr herausfordernd. Die bakteriellen Enzyme Arylmalonat-Decarboxylaseund Eudesmolsynthase katalysieren diese Reaktionen mit herausragender Selektivität. Das Vorhaben Active Site Design beschäftigt sich mit den molekularen Ursachen dieser Selektivität, die zum einen in der Stabilisierung geladener Intermediate, zum anderen in der selektiven Neutralisierung dieser Intermediate an spezifischen Positionen im Molekül vermutet werden. Über die gezielte Einführung funktionaler Gruppen sollen die Reaktionen beider Enzyme zur Bildung neuer Produkte umgelenkt werden. Dazu werden die Mechanismen mit molekularem Modellierung und kinetischen Untersuchungen aufgeklärt. Aufgrund der Schwierigkeit, exakte mechanistische Vorhersagen zu treffen, werden Sets an Aminosäuren im aktiven Zentrum randomisiert und in einem Hochdurchsatzdurchmusterungsassay nach verbesserten Varianten gesucht. Zur präzisen Modifizierung der Wechselwirkungen zwischen Substrat und Protein sollen funktionelle Gruppen eingesetzt werden, die in natürlichen Enzymen nicht vorhanden sind. Hierzu werden molekularbiologische Verfahren zur Einführung unnatürlicher Aminosäuren eingesetzt. Der Ansatz von Active Site Design liegt in der präzisen Beeinflussung von Enzymmechanismen über die gezielte Einführung neuer funktionaler Gruppen und eine simultane Variation des molekularen Kontextes. Über eine optimale Einbettung der unnatürlichen Aminosäuren in die Wechselwirkungen im aktiven Zentrum von Enzymen sollen so neue Reaktivitäten erreicht werden. Schlüssel ist eine interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Enzym Engineering auf der einen und organischer Synthese und mechanistischen Studien auf der anderen Seite. 1

Das Projekt "Active site design" untersuchte Mechanismen der enzymatischen Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen ohne Unterstützung durch organische Cofaktoren. Der Schwerpunkt lag auf dem mechanistischen Verständnis und der technischen Entwicklung der bakteriellen Arylmalonat-Decarboxylase, die einfache Ausgangsstoffe ohne Verwendung toxischer Metalle in chirale Produkte umwandeln kann. Eine zentrale Frage war, wie dieses Enzym steuert, welches Enantiomer gebildet wird. Überraschenderweise zeigte sich, dass die neu entwickelte Enzymvariante nach einem anderen mechanistischen Prinzip funktioniert, bei dem Bindungsaufbruch und Bindungsaufbau gleichzeitig stattfinden.Mit den aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnissen konnten wir die Anwendbarkeit dieses Enzyms auf andere Substrate ausweiten. Darüber hinaus haben wir die evolutionären Ursprünge dieser Enzymfamilie untersucht. Durch die Rekonstruktion der ursprünglichen Versionen der Arylmalonat-Decarboxylase erhielten wir Enzymvarianten mit verbesserter Robustheit und Stereoselektivität. Insgesamt liefert das Projekt sowohl grundlegende Erkenntnisse als auch praktische Hinweise: Es erklärt, wie Protein Engineering mechanistische Änderungen der Stereochemie verursachen, und es zeigt, dass die Rekonstruktion von Vorfahren stabile, leistungsstarke Ausgangspunkte für zukünftige Biokatalysatoren bieten kann. Dies leistet einen Beitrag zur Entwicklung umweltfreundlicherer Verfahren zur Herstellung hochwertiger optisch reiner Chemikalien.