Neue Tools für Proteomweite Crosslinking Massenspektrometrie

Dieses Projekt widmet sich der technisch-methodischen Etablierung eines vollständigen Ansatzes zur Erforschung von Proteininteraktionsnetzwerken in lebenden Zellen. Solche komplexen Netzwerke sind essenziell für den Ablauf und die Regulierung aller biochemischen Reaktionen in einer Zelle und damit ist ihr Verständnis von großem Interesse in der Grundlagenforschung. Um miteinander wechselwirkende Proteine sichtbar zu machen, werden in diesem Projekt chemische Reagenzien (Cross-Linker) benutzt, die selektiv mit bestimmten reaktiven Regionen von Proteinen reagieren können. Auf diese Weise werden Proteine miteinander vernetzt und stabilisiert. In dieser Form können sie isoliert und danach enzymatisch kleingeschnitten werden. Die durch Cross-Linker verbundenen Proteine können mithilfe eines Massenspektrometers identifiziert und die Position ihrer Wechselwirkung lokalisiert werden. Im Massenspektrometer kann eine Art Fingerabdruck der zerkleinerten Proteine detektiert werden und dank der Cross-Linker kann auf deren ursprüngliche Anordnung in der Zelle rückgeschlossen werden. Leider ist die chemische Reaktion dieser Cross-Linker nicht sehr effizient, was die direkte Detektion im Massenspektrometer sehr schwer macht. Um dieses Problem zu lösen, werden wir einerseits neuartige Cross-Linker Reagenzien mit verbesserter Reaktivität herstellen und testen und andererseits werden wir mithilfe spezieller reaktiver Seitenketten an den Cross-Linkern diese anreichern. Durch Kombination und Optimierung dieser beiden Strategien planen wir sehr saubere Proben in ausreichender Menge herzustellen in denen die Detektion der Cross-Linker effektiv funktioniert. Im nächsten Schritt erfolgt eine computerbasierte Auswertung der generierten Daten. Dafür haben wir bereits eine Software entwickelt, die mehr Cross- Links identifizieren kann als konkurrierende Algorithmen und dabei weniger fehleranfällig ist. Diese Software soll nun weiterentwickelt werden und mithilfe eines Maschinenlernalgorithmus soll die korrekte und exakte Positionierung der Cross-Links auf dem Protein weiter verbessert werden. Zusätzlich wird die Funktionalität auf verschiedenartige Cross-Linker Typen ausgeweitet. In einem finalen Schritt des Projekts soll die neue Methode angewendet werden, um Unterschiede der Proteininteraktionen in Bereichen der Zelle, in denen das Erbgut dicht gepackt ist, im Vergleich zu Bereichen, in denen das Erbgut leichter zugänglich ist, zu erforschen. Diese Forschung wird das Verständnis darüber, wie das Erbgut abgelesen wird, vertiefen.