Neue Tools für Proteomweite Crosslinking Massenspektrometrie

Dieses Projekt widmet sich der technisch-methodischen Etablierung eines vollständigen Ansatzes zur Erforschung von Proteininteraktionsnetzwerken in lebenden Zellen. Solche komplexen Netzwerke sind essenziell für den Ablauf und die Regulierung aller biochemischen Reaktionen in einer Zelle und damit ist ihr Verständnis von großem Interesse in der Grundlagenforschung. Um miteinander wechselwirkende Proteine sichtbar zu machen, werden in diesem Projekt chemische Reagenzien (Cross-Linker) benutzt, die selektiv mit bestimmten reaktiven Regionen von Proteinen reagieren können. Auf diese Weise werden Proteine miteinander vernetzt und stabilisiert. In dieser Form können sie isoliert und danach enzymatisch kleingeschnitten werden. Die durch Cross-Linker verbundenen Proteine können mithilfe eines Massenspektrometers identifiziert und die Position ihrer Wechselwirkung lokalisiert werden. Im Massenspektrometer kann eine Art Fingerabdruck der zerkleinerten Proteine detektiert werden und dank der Cross-Linker kann auf deren ursprüngliche Anordnung in der Zelle rückgeschlossen werden. Leider ist die chemische Reaktion dieser Cross-Linker nicht sehr effizient, was die direkte Detektion im Massenspektrometer sehr schwer macht. Um dieses Problem zu lösen, werden wir einerseits neuartige Cross-Linker Reagenzien mit verbesserter Reaktivität herstellen und testen und andererseits werden wir mithilfe spezieller reaktiver Seitenketten an den Cross-Linkern diese anreichern. Durch Kombination und Optimierung dieser beiden Strategien planen wir sehr saubere Proben in ausreichender Menge herzustellen in denen die Detektion der Cross-Linker effektiv funktioniert. Im nächsten Schritt erfolgt eine computerbasierte Auswertung der generierten Daten. Dafür haben wir bereits eine Software entwickelt, die mehr Cross- Links identifizieren kann als konkurrierende Algorithmen und dabei weniger fehleranfällig ist. Diese Software soll nun weiterentwickelt werden und mithilfe eines Maschinenlernalgorithmus soll die korrekte und exakte Positionierung der Cross-Links auf dem Protein weiter verbessert werden. Zusätzlich wird die Funktionalität auf verschiedenartige Cross-Linker Typen ausgeweitet. In einem finalen Schritt des Projekts soll die neue Methode angewendet werden, um Unterschiede der Proteininteraktionen in Bereichen der Zelle, in denen das Erbgut dicht gepackt ist, im Vergleich zu Bereichen, in denen das Erbgut leichter zugänglich ist, zu erforschen. Diese Forschung wird das Verständnis darüber, wie das Erbgut abgelesen wird, vertiefen.

Unser Projekt hat die Crosslinking-Massenspektrometrie (XL-MS) entscheidend vorangebracht - eine Technologie, die nicht nur für die Strukturbiologie relevant ist, sondern auch aufzeigt, wie Proteine innerhalb von Zellen miteinander interagieren. Diese Interaktionen bilden die molekularen Netzwerke, die Lebensprozesse steuern. Ihr Verständnis ist entscheidend, um Krankheiten wie Krebs oder neurodegenerative Erkrankungen zu bekämpfen. Traditionelle XL-MS-Methoden stoßen bei Effizienz, Robustheit und Abdeckung an Grenzen. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, diese Einschränkungen durch neue chemische Werkzeuge, Anreicherungsstrategien und computergestützte Lösungen zu überwinden. Wichtige Errungenschaften: Innovative chemische Linker-Moleküle: Wir haben neuartige Reagenzien wie DISPASO entwickelt und optimiert, welches innerhalb weniger Minuten in Zellen und Zellkerne eindringt und effizientes in vivo Crosslinking ermöglicht. Außerdem führten wir DSSO-Carbamat ein - eine stabilere Alternative zu bestehenden Linkern - und begannen mit der Entwicklung von photospaltbaren funktionellen Gruppen welche zur Aufreinigung benutzt werden können. Diese Innovationen ermöglichen die Erfassung bisher unzugänglicher Proteininteraktionen. Durchbruch bei der Abdeckung: Durch die Optimierung unserer Workflows konnten wir die Anzahl identifizierter Crosslink-Stellen von 1.000 im Jahr 2023 auf über 5.000 im Jahr 2025 steigern. Damit kartierten wir Interaktionsnetzwerke von fast 400 Proteinen und entdeckten 56 neue Verbindungen. Dazu gehören Einblicke in die RNA-Biologie, wie die strukturelle Dynamik der DDX39-Proteine, und die Unterstützung bei der (Re-)Modellierung KI-gestützter 3D-Proteinstrukturen. Low-Input-Fähigkeit: Wir konnten erfolgreich Crosslinking mit nur 25 Nanogramm Protein demonstrieren - vergleichbar mit Ergebnissen, die zuvor 40-mal mehr Material erforderten. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für Studien mit knappen Proben. Computational Advances: Unsere Partnergruppe veröffentlichte MS Annika 3.0, eine neue Generation von Suchalgorithmen für XL-MS-Daten. Sie führt einen neuartigen Ansatz für nicht-spaltbare Crosslinker ein und ermöglicht proteomweite Studien, die bisher unmöglich waren. MS Annika 3.0 übertrifft Konkurrenztools in Genauigkeit und Geschwindigkeit, reduziert Fehlidentifikationen um 75 % und unterstützt GPU-Beschleunigung für Hochdurchsatzanalysen. Die Software ist Open Source und in gängige Plattformen integriert. Kooperative Wirkung: Gemeinsam wendeten wir diese Werkzeuge auf komplexe biologische Systeme wie den Box C/D RNP-Komplex von C. elegans an und veröffentlichten mehrere Open-Access-Studien. Unsere Arbeit setzt neue Standards für XL-MS und verbindet Chemie, Biologie und KI-gestützte Berechnungen. Diese Fortschritte machen XL-MS zu einem leistungsstarken Werkzeug, um Protein-Netzwerke in bisher unerreichter Tiefe und Breite zu erforschen. Dies ist von großer Bedeutung für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Beschleunigung der Wirkstoffentwicklung. Durch die offene Bereitstellung unserer Workflows und Software ermöglichen wir Forschenden weltweit, die Grenzen der Strukturbiologie zu erweitern.