Die Kraft von Zucker bei der SARS-CoV-2 Spike/ACE-2 Bindung

Virus-Rezeptor-Interaktionen sind für die Etablierung einer Infektion von zentraler Bedeutung. Viren, insbesondere RNA-Viren wie SARS-CoV-2, entwickeln sich ständig weiter; alle Mutationen im viralen Spike-Oberflächenglykoprotein, insbesondere in der Rezeptorbindungsdomäne, müssen deshalb sorgfältig überwacht werden. Auch die Eintrittspforte für SARS-CoV-2, der menschliche Rezeptor ACE-2, zeigt eine gewisse Heterogenität in Form von Einzelnukleotid-Polymorphismen. Das virale Spike-Protein und der ACE-2 Rezeptor sind stark glykosyliert und Glykane sind direkt an der Interaktion der beiden Proteine beteiligt, oder begünstigen diese. Mutationen im Spike-Protein, als auch Einzelnukleotid- Polymorphismen im ACE-2 Gen, die zum Verlust strategisch positionierter Glykane in oder nahe der Bindungsdomänen führen, erfordern unsere Aufmerksamkeit. Sie könnten die Anfälligkeit für eine SARS- CoV-2 Infektion und die Übertragbarkeit von Viren erhöhen. Ein tiefgreifendes Verständnis der Virus- Rezeptor-Interaktionen ist daher von erheblicher Bedeutung. Sie ermöglicht es, unser Wissen über die Affinität des Virus für bestimme Spezien, als auch Gewebearten und die Pathogenese in bestimmten menschlichen Populationen zu erweitern und uns frühzeitig auf neu auftretende Varianten von Belang vorzubereiten. Das übergeordnete Ziel dieses Projekts ist es, verschiedene Spike- und ACE-2-Glykovarianten herzustellen und deren Interaktion zu analysieren. Im Gegensatz zu bisherigen Studien, die auf bereits verbreitete Spike-Varianten und dem Wildtyp-Rezeptor ACE-2 basieren, legen wir einen besonderen Fokus auf spezifische Glykosylierungsstellen der Interaktionspartner, von denen aufgrund ihrer strategischen Position angenommen wird, dass sie die Virus-Wirt-Interaktion beeinflussen. Der Schwerpunkt liegt hier auf natürlich vorkommenden ACE-2-Glykovarianten-Polymorphismen. Verschiedene Spike/ACE-2 Glykomutanten werden auf deren Fähigkeit untersucht unter dynamischen Bedingungen zu interagieren, wir werden die Bindungsstärken und -kinetik quantifizieren und ihre Interaktionsenergielandschaft kartieren. Weiters wird die strukturelle Rolle gewisser Glykosylierungen auf die Konformationsdynamik, als auch die inhibitorische Wirkung löslicher ACE-2-Glykovarianten auf die Bindung von Spike- Glykomutanten an zelluläre ACE-2-Rezeptoren untersucht. Lösliche SARS-CoV-2-Spike- und ACE-2- Glykomutanten werden rekombinant in humanen Zelllinien exprimiert und durch quantitative Glykopeptid-Analyse umfassend charakterisiert. Die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Proteinvarianten werden in Einzelmolekül- und Rasterkraftmikroskopie-Experimenten analysiert, die im Gegensatz zu Ensemble-Methoden jedes einzelne Bindungs-/Dissoziationsereignis erfassen können. Hochgeschwindigkeits-AFM-Filme werden die dynamischen Konformationsänderungen von isolierten SARS-CoV-2-Spike-Protein-Glykomutantendirekt filmen. Unsere umfassenden Untersuchungen werden nicht nur zu einer wertvollen Datensammlung für die Entschlüsselung der Mechanismen der Spike-ACE-2-Varianten-Interaktion führen, sondern auch eine experimentelle Grundlage für das Design neuartiger Therapeutika zur effektiven Blockierung des Eintritts von viralenVariantenliefern.

Die Wechselwirkungen zwischen Virus und Rezeptor sind entscheidend für die Entstehung einer Infektion. Viren, insbesondere RNA-Viren wie SARS-CoV-2, entwickeln sich ständig weiter, und alle Mutationen im viralen Spike-Oberflächenglykoprotein, insbesondere in der rezeptorbindenden Domäne, müssen sorgfältig überwacht werden. Auch die Eintrittspforte für SARS-CoV-2, der Rezeptor ACE-2, weist beim Menschen Heterogenität auf. Das virale Spike-Protein und der menschliche Rezeptor sind stark glykosyliert und Glykane unterstützen indirekt die Interaktion der beiden Proteine oder sind direkt an ihr beteiligt. Mutationen im viralen Spike-Protein oder ACE-2-Einzel-Nukleotid-Polymorphismen, die zum Verlust eines strategisch positionierten Glykans in oder nahe der Bindungsschnittstelle führen, bedürfen daher unserer Aufmerksamkeit, da sie im schlimmsten Fall die Anfälligkeit für virale Infektionen und die Übertragbarkeit erhöhen können. Ein tiefgreifendes Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Viren und Rezeptoren ist von großer Bedeutung, da es uns ermöglicht, unser Wissen über den Gewebe- und Speziestropismus, die Pathogenese in bestimmten menschlichen Populationen und die frühzeitige Vorbereitung auf neu auftretende Varianten zu erweitern. Wir haben verschiedene Spike- und ACE-2-Varianten mit ortsspezifischen Ablationen von Glykosylierungsstellen innerhalb der Bindungsschnittstelle hergestellt und analysiert, wobei der Schwerpunkt auf natürlich vorkommenden ACE-2-Glykovarianten-Polymorphismen lag. Die Fähigkeit der Interaktionspartner, unter dynamischen Bedingungen zu binden, wurde bewertet und die Bindungsstärken und -kinetik wurden quantifiziert, um ihre Interaktionsenergielandschaft abzubilden. Darüber hinaus haben wir die strukturelle Rolle der Spike-Glykomutationen und ihre Beteiligung an der Modulation ihrer Konformationsdynamik sowie die hemmende Wirkung löslicher ACE-2-Glykovarianten auf die Bindung von Spike-Glykomutanten an zelluläre ACE-2-Rezeptoren untersucht. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden lösliche SARS-CoV-2-Spike- und ACE-2-Glykomutanten in menschlichen Zelllinien rekombinant exprimiert und durch quantitative Glykopeptid-Analyse umfassend charakterisiert. Die Wechselwirkungen zwischen ihnen wurden in Einzelmolekül- und Zellkraftspektroskopie-Experimenten analysiert, die im Gegensatz zu Ensemble-Methoden jedes einzelne Bindungs- und Entbindungsereignis erfassen können. Hochgeschwindigkeits-AFM filmte direkt die dynamischen Konformationsänderungen von isolierten SARS-CoV-2-Spike-Protein-Glykomutanten. Im Gegensatz zu früheren Studien mit bereits bekannten Spike-Varianten und dem Wildtyp-Rezeptor ACE-2 legten wir einen besonderen Fokus auf spezifische Glykosylierungsstellen der Interaktionspartner, die aufgrund ihrer proximalen/strategischen Position die Virus-Wirt-Interaktion beeinflussen sollen. Unsere umfassenden Untersuchungen führten nicht nur zu einer wertvollen Datensammlung für die Entschlüsselung der Mechanismen der Interaktion zwischen Spike und ACE-2-Variante, sondern lieferten auch eine experimentelle Grundlage für die Entwicklung neuartiger Therapeutika zur wirksamen Blockierung des Eintritts der viralen Variante.