Cav1.3-selektive L-Typ Kalziumkanalblocker

Als Ionenkanäle bezeichnet man Eiweissmoleküle, welche durch ihr gezieltes Öffnen Ionenströme über Zellmembranen ermöglichen. Die Aktivität von Ionenkanälen ist Voraussetzung für die normale Funktion aller lebenden Organismen. Viele dieser Ionenkanäle ermöglichen selektiv die Permeation nur von bestimmten Ionen, wie z.B. Natrium, Kalium oder Kalzium. Spannungsabhängige Ionenkanäle mit Selektivität für Kalziumionen (sog. spannnungsabhängige Kalziumkanäle, SKK) öffnen bei elektrischer Erregung von Zellen, wie Herzmuskel-, Gefäßmuskel-, Nerven- oder hormonproduzierenden Zellen. Dadurch kommt ihnen eine große Bedeutung für viele physiologische Funktionen zu. Seit Jahrzehnten sind Medikamente, welche SKK im Herzkreislaufsystem hemmen, erfolgreich als Blutdrucksenker im klinischen Einsatz. In früheren FWF-geförderten Projekten konnten wir nachweisen, dass diese blutdrucksenkende Wirkung durch die Hemmung der SKK vom sog. Cav1.2 Typ erfolgt. Jüngere Forschungsergebnisse unserer und anderer Arbeitsgruppen ergeben nun Hinweise auch für eine mögliche therapeutische Bedeutung des Cav1.3-Typs, z.B. für die Behandlung von Morbus Parkinson, therapie-resistenten Formen der Hypertonie oder chronischen Muskelspasmen nach Rückenmarksverletzungen. Ziel dieses Forschungsprojekts ist es daher, für den Cav1.3-Typ selektive und potente Inhibitoren zu entdecken. Dazu werden daher diese SKK und andere SKK-Typen in Säugerzellen in Zellkulturen exprimiert, um die Hemmung durch Arzneistoffe zu untersuchen. Dies gelingt durch Messung der Ionenströme mithilfe etablierter elektrophysiologischer Methoden (Whole-Cell Patch Clamp). Wirkstoffe mit möglicher Cav1.3-Selektivität stehen dabei bereits am Projektbeginn für die weitere Charakterisierung zur Verfügung. Parallel werden moderne Computermethoden (ligand- and structure-based molecular modeling) verwendet, um auf Basis von uns bereits erstellter Computermodelle des Cav1.3-Kanals mögliche Cav1.3-selektive chemische Strukturen zu identifizieren. Der Vergleich der vorhergesagten Aktivität mit den gemessenen elektrophysiologischen Eigenschaften erlaubt die ständige Verbesserung der Vorhersagekraft dieser Computermodelle. Dieses Projekt hat das Potential, mögliche Leitstrukturen mit den gewünschten pharmakologischen Eigenschaften zu identifizieren, welche die Grundlage für weitere präklinische Studien zur Überprüfung ihrer möglichen Eignung als klinischen Wirkstoffkandidaten bilden könnten.

Wir haben mehrere therapeutisch relevante Fragen zur Pharmakologie der Cav1.3 L-Typ Ca2+-Kanäle untersucht: 1. Können Krankheitssymptome bei Patienten mit einem neurologischen Entwicklungsstörung, das durch aktivitätssteigernde Mutationen in Cav1.3 verursacht wird, bei Hemmung der hyperaktiven Kanäle durch Behandlung mit bereits zugelassenen Kalziumkanalblockern (KKB) verbessert werden; 2. sind die mutierten Kanäle immer noch empfindlich gegenüber diesen Blockern und 3. ist es möglich, Cav1.3-selektive Inhibitoren zu entwickeln, da verfügbare KKB auch Cav1.2-Kanäle hemmen und dadurch Hypotonie verursachen können. Wir nutzten ein von uns generiertes Krankheitsmodell (FWF-Projekt P27809), in welchem die humanpathogene Mutation A749G in Mäuse eingefügt wurde. Diese zeigten Verhaltensanomalien, die dem Phänotyp des A749G-Patienten entsprechen (Autismus-ähnliches Verhalten und Hyperaktivität in neuer Umgebung). Wir entwickelten ein neuartiges Verfahren (einschließlich einer separaten pharmakokinetischen Studie) zur oralen Verabreichung des KKB Isradipin, konnten jedoch bei therapeutischen Plasmaspiegeln keine Wirkung auf die pathologische Hyperaktivität in diesem Mausmodell feststellen. Ebenso wurde bei einem Patienten mit einer ähnlichen, pathogenen Mutation keine klinisch bedeutsame Verbesserung durch eine Isradipin-Behandlung beobachtet. Diese fehlende Wirkung lässt sich möglicherweise durch unsere Antwort auf Frage 2 erklären: Wir entdeckten, dass die zuvor beobachtete höhere Empfindlichkeit mehrerer pathogener Mutanten (wie A749G) für Isradipine nur bei negativen Haltepotentialen in elektrophysiologischen Standardprotokollen zu beobachten ist. Die scheinbare Isradipin-Empfindlichkeit sowohl von Wildtyp- und mutanten Cav1.3-Kanälen (von uns für A749T und L271H gezeigt) nimmt bei positiveren Haltepotentialen zu, da Isradipin eine etwa 100-fach höhere Affinität für inaktivierte Kanäle besitzt. Bemerkenswert ist, dass die IC50-Werte nur im therapeutischen, niedrig-nanomolaren Konzentrationsbereich liegen, wenn etwa 50 % der Kanäle inaktiviert sind. Dies lässt darauf schließen, dass therapeutische Konzentrationen von Isradipin Wildtyp- und mutierte Cav1.3-Kanäle nur Subpopulationen von Neuronen hemmen, die unter Bedingungen von stärker depolarisierten Membranpotenzialen operieren. Dies könnte für eine symptomatische Wirkung in unserem Mausmodell und beim Menschen (z. B. auf Hyperaktivität oder selbstverletzendes Verhalten) unzureichend sein. Wir haben daher auch die Entwicklung von neuen Cav1.3-selektiven CCBs angestrebt, die für die Behandlung von Patienten mit CACNA1D-Mutationen, aber auch für eine Reihe anderer menschlicher Erkrankungen von Nutzen sein könnten, wie z. B. bei Spastizität nach spinalen Traumata, behandlungsresistenter Hypertonie und Morbus Parkinson. Mit Hilfe von in silico-basierter Wirkstoffsuche und elektrophysiologischem Screening unter Verwendung stabil Cav1.2- und Cav1.3-exprimierender HEK293-Zelllinien haben wir bereits zwei Leitstrukturen mit 10-facher Selektivität für Cav1.3 identifiziert. Darüber hinaus haben wir >20 Verbindungen getestet, die strukturell mit Compound-B, einem etwa 10-fach Cav1.3 selektiven Inhibitor verwandt sind. Diese Studie hat bereits gezeigt, dass keines der Analoga potenter oder selektiver ist als Compound-B. Interessanterweise scheint sich die Potenz von Compound-B bei verschiedenen Cav1.3-Spleißvarianten zu unterscheiden. Wir haben auch gezeigt, dass Sclareol ein Naturstoff mit angeblicher Cav1.3-Selektivität, nur ein schwach wirksamer und unselektiver Inhibitor ist.