Visuelle Proteomik zur Analyse subzellulärer Proteindynamik

Die Fortschritte in der Proteomik auf der Grundlage der Massenspektrometrie haben tiefe Einblicke in die Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke in intakten Zellen ermöglicht. Die Analyse dynamischer Veränderungen im gesamten Proteom ist jedoch nach wie vor eine Herausforderung, insbesondere für Veränderungen der Proteinlokalisierung auf subzellulärer und suborganeller Ebene. Wir haben vor kurzem einen Massenspektrometrie-unabhängigen Ansatz entwickelt, bei dem wir mit Hilfe von gepooltem Intron-Tagging und Fluoreszenzmikroskopie die Lokalisationen und Konzentrationen von Hunderten von Stoffwechselenzymen parallel sichtbar machen. Unser Ziel ist es, diese Technologie auf den Proteom-weiten Maßstab auszudehnen und sie umfassend zu validieren. Außerdem wollen wir damit die Hypothese testen, dass die subzelluläre und suborganellare Lokalisierung von Proteinen ihr dynamisches Verhalten abhängig von Proteinhomöostase-Mechanismen beeinflusst, und zwar mit besonderem Augenmerk auf Substanzen und therapeutische Targets, die bei der Behandlung von Multiplem Myelom eine Rolle spielen. Dazu werden wir einen Zellpool erstellen, der mehr als 5.000 fluoreszenzmarkierte Proteine enthält, die von ihren endogenen Promotoren exprimiert werden. Parallel dazu werden wir eine computergestützte Methode zur automatischen Erkennung dieser Klone entwickeln, auf der Grundlage der klonspezifischen Konzentrationen und Lokalisierungen von Proteinen in fünf komplementären Fluoreszenzkanälen pro Zelle. Anschließend werden wir den Zellpool mit niedermolekularen Substanzen behandeln, von denen bekannt ist, dass sie globale dynamische Veränderungen in der Lokalisierung und Häufigkeit mehrerer Proteine bewirken. Mittels bereits bekannter Veränderungen ausgewählter Proteine werden wir unseren Zellpool funktionell validieren und unsere Analysepipeline testen. Wir erwarten, dass wir neben der Wiederentdeckung bekannter Veränderungen auch Veränderungen in der Lokalisierung und Menge zusätzlicher Proteine beobachten werden. Für diese Proteine werden wir dann die beobachteten Lokalisierungsveränderungen und ihre funktionelle Bedeutung an endogenen, nicht markierten Proteinen validieren. Dieses Projekt zielt darauf ab, eine hochinnovative neue Technologie zur Erkennung von Veränderungen im Proteomzu etablieren,dieauf der fluoreszenzmikroskopischen Analyse von markierten Zellpools basiert. Im Gegensatz zu alternativen Technologien ist dieser Ansatz leicht auf verschiedene Zellmodelle übertragbar und ermöglicht den Nachweis von Veränderungen nicht nur in der Abundanz, sondern auch in der subzellulären Lokalisierung von Proteinen. Letzteres ist von besonderer Bedeutung, um zu prüfen, ob Proteine in verschiedenen (sub)organellaren Lokalisationen unterschiedliche Proteinhomöostase-Mechanismen nutzen.