NMR spektroskopische Untersuchung eines Chaperonkomplexes

Die dreidimensionale Struktur eines Chaperonkomplexes in wäßriger Lösung wird mittels Kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) ermittelt werden. Chaperone sind Proteine die ungefaltete oder mißgefaltete Proteine darin unterstützen ihre gefaltete, native Struktur zu erlangen. Chaperone bilden oftmals Teil eines Netzwerks von spezifischen Proteinfaltungsfaktoren, welches als qualitätssicherndes System agiert und gewährleistet, daß nur die erwünschte, richtig gefaltete und biologisch aktive Form von Proteinen produziert wird. Das Ziel dieses Projekts ist die strukturelle Untersuchung eines Komplexes bestehend aus zwei Chaperonmolekülen, welcher im Endoplasmatsichen Retikulum an der Faltung von Glycoproteinen (wie unter anderem verschiedener Zellmembranrezeptoren, Transmembrankanäle und Serumproteine) beteiligt ist. Im Detail besteht dieser Komplex aus dem Glycoprotein-bindenden Chaperon Calreticulin und der Proteindisulfidisomerase ERp57, einem weiteren, aus mehreren Domänen aufgebauten Chaperon. Die Größe des im Zuge dieses Projekts untersuchten Proteinkomplexes erreicht das obere Limit für biologischen Makromoleküle, die mit den momentan verfügbaren NMR spektroskopischen Methoden untersuchbar sind. In Zusammenarbeit mit den Labors von Prof. Robert Konrat an der Universität Wien und Prof. Lewis E. Kay an der Universität Toronto wird die existierende NMR spektroskopische Methodik für das Studium von Proteinen mit hohem Molekulargewicht weiter optimiert werden. Zur Resonanzzuordnung wird eine Serie von drei- und vierdimensionalen Tripelresonanzexperimenten herangezogen werden; hierzu werden die Proteine an NMR aktiven Isotopen (15N, 13C, 2H) angereichert werden. Strukturelle Information wird von einer Vielzahl anisotroper und isotroper Wechselwirkungen, wie zum Beispiel dipolarer Kopplungen, Anisotropie der chemischen Verschiebung, Kern-Overhauser Effekt und isotropen chemischen Verschiebungen, abgeleitet werden. Die aus dipolaren Kopplungen ableitbare `weitreichende` strukturelle Information eignet sich insbesondere zur Bestimmung der relativen räumlichen Orientierung individueller Komponenten komplexer Systeme wie ERp57/Calreticulin. Mittels dieser Methoden wird der räumliche Aufbau des Chaperonkomplexes bestimmt werden, d.h die Orientierung der einzelnen Proteindomänen in ERp57 sowie die Orientierung der zwei Chaperonmoleküle zueinander. Des weiteren werden dynamische Eigenschaften der Chaperonmoleküle mittels Relaxationsmessungen untersucht werden. Die biologische Funktion von Proteinen steht in nahem Bezug zur dreidimensionalen Struktur sowie dynamischen Eigenschaften; die Untersuchung dieses Chaperonkomplexes wird neue Einsichten in den molekularen Mechanismus der unterstützten Proteinfaltung bieten.