Prozessierung und Stabilität mitochondrialer RNAs

Herta-Firnberg-Stelle T 105Prozessierung und Stabilität mitochondrialer RNAsGerlinde WIESENBERGER27.06.2000 Organellen besitzen ihr eigenes Genom, dessen Expression vor allem durch kernkodierte Gene kontrolliert wird. Die Regulation der mitochondrialen Genexpression spielt sich vor allem auf der post-transkriptionellen Ebene ab. Zur Zeit gibt es noch wenige und sehr punktuelle Informationen über Gene, die für die Prozessierung und den Abbau mitochondrialer Transkripte benötigt werden. Im vorliegenden Projekt soll die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus verwendet werden, um die molekularen Mechanismen des RNA Metabolismus in Mitochondrian zu studieren. Eines der Kerngene aus Saccharomyces cereviside, die Einfluss auf die 5-Prozessierung und Abbau mitochondrialer RNAs haben, ist PET 127, welches im Rahmen einer früheren Arbeit isoliert und charakterisiert wurde. PET127 kodiert für ein mitochondriales Membranprotein, das vermutlich für die 5-Prozessierung mehrerer mitochondrialer Transkripte benötigt wird und/oder eine wichtige Kontrollfunktion im Abbau mitochondrialer RNAs haben könnte. Im Rahmen des Projektes sollen Suppressoren einer pet127 Deletion untersucht werden und ausserdem Mutationen in anderen Kerngenen identifiziert werden, die zu einem synthetischen Defekt zusammen mit einer Deletion von PET127 führen. Die Überexpression von PET127 in Wildtypstämmen führt zum rapiden und irreversiblen Verlust der mitochondrialen DNA. Es ist geplant, Gene zu suchen, die imstande sind -durch Überexpression-oder Mutation diesen Effekt der PET127 Überexpression zu unterdrücken. Die Gene, die in den oben genannten genetischen- Ansätzen gefunden werden, sollen untersucht werden. Ihre Funktionen in der Hefe werden durch Gendisruption und Überexpression studiert werden und ihr Zusammenspiel wird auch biochemisch untersucht werden. Eine am 3`-Ende aller mitochondrialen mRNAs vorhandene konservierte Sequenz, (Dodekamerequenz) ist wahrscheinlich für die Prozessierung mitochondrialer mRNAs verantwortlich. Weiters wird vermutetet, dass Proteine, die an diese Dodekamersequenz binden, mitochondriale mRNAs vor dem Abbau durch eine 3`-5` Exonuklease beschützen. Um die Funktion dieser konservierten Sequenz zu untersuchen, soll diese Dodekamersequenz in einem Reportergen mutiert werden. Die Konsequenzen der Mutationen sollen untersucht werden. Weiters ist geplant, durch eine Kombination von genetischen und biochemischen Methoden Gene zu suchen, die für Proteine kodieren, welche an these Dodekamersequenz binden. Mittels Gendisruption sollen die Funktionen dieser Gene untersucht werden. Durch these Untersuchungen soil nicht nur das Verstandnis über den RNA Metabolismus in Mitochondrien der Bäckerhefe vertieft werden, sie sollen auch dazu beitragen, Rückschlüsse auf ähnliche Funktionen in Organellen höherer Eukaryonten machen zu können.

Mitochondrien, die `Kraftwerke` der eukaryontischen Zelle, besitzen ihr eigenes Genom, das vor allem Gene enthält, deren Produkte für die Energiegewinnung durch Atmung benötigt werden. Im Gegensatz zum Kerngenom werden in Mitochondrien nicht einzelne Gene an- und abgeschaltet, sondern es werden zuerst große Teile des mitochondrialen Genoms in einem Stück transkribiert und die resultierenden Vorläufer-RNAs in komplizierten Reaktionen in die relevanten Teile zerlegt (RNA Prozessierung). Diese Prozessierungsschritte werden von kernkodierten Proteinen durchgeführt, die nach ihrer Synthese im Zytoplasma in die Mitochondrien importiert werden. Über die Natur und genaue biochemische Funktion dieser Proteine ist bisher sehr wenig bekannt. Im vorliegenden Projekt wurden die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe als Modellsysteme verwendet, um Gene und die davon abgeleiteten Proteine zu studieren, die bei der Reifung und beim Abbau mitochondrialer RNAs benötigt werden. Um die Funktion des Pet127 Proteins zu studieren wurde das PET127 Gen deletiert und die Auswirkungen dieser Deletion auf Wachstum und RNA Prozessierung und Stabilität studiert. Dieses Experiment wurde sowohl in der Bäckerhefe als auch in der Spalthefe, welche evolutionär sehr wenig verwandt sind, durchgeführt. Weiters wurde die Funktion des PET127 der Spalthefe in der Bäckerhefe untersucht und es zeigte sich, dass dieses Gen die Funktion des PET127 aus der Bäckerhefe übernehmen kann. Suchen in verschiedenen Datenbanken ergaben, dass das viele niedere Eukaryonten-Genome (darunter jene vieler pathogener Pilze) für Proteine kodieren, die eine starke Sequenzähnlichkeit mit dem Pet127p Protein haben. Es konnten jedoch keine Hinweise darauf gefunden werden, dass auch höhere Eukaryonten (Pflanzen und Tiere) ein solches Protein enthalten. Daraus kann geschlossen werden, dass die Funktion des Pet127 Proteins nur in Pilzen wichtig ist und dass Pflanzen und Tiere andere Mechanismen zur mitochondrialen RNA Reifung und Abbau verwenden. Die Erkenntnisse über spezifische Unterschiede in der mitochondrialen Genexpression zwischen Hefe (einem Pilz) und Pflanzen bzw. Säugetieren könnten wichtige Grundlagen für der Entwicklung neuer pilzhemmender Therapeutika bilden, die an diesem biochemischen Unterschied ansetzten. Im vorliegenden Projekt wurde ein weiterer Aspekt der mitochondrialen Biogenese studiert: die Erhaltung der richtigen Konzentration bestimmter Metallionen innnerhalb der Mitochondrien. Die Aufrechterhaltung der physiologischen Ionenkonzentrationen ist in allen Organismen von fundamentaler Bedeutung. Störungen im mitochondrialen Metallionen-haushalt können schwere Erkrankungen hervorrufen (Friedreichs Ataxie, Menkes Syndrom, Wilson Krankheit). Friedreichs Ataxie ist eine Erkrankung, bei der durch die erniedrigte Konzentration eines mitochondrialen Proteins (Frataxin) die Mitochondrien stark mit Eisen überladen werden. Im Rahmen dieses Projektes wurde die Funktion der Hefeproteine Mrs3p und Mrs4p untersucht. Die beiden Proteine gehören zu einer Familie von konservierten Proteinen, die in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert sind und für den Transport verschiedener Stoffwechselprodukte in die Mitochondrien benötigt werden. Hier konnte gezeigt werden, die Deletion der beiden Gene zu einer Änderung des Eisenhaushalts der Hefe führen und dass die Proteine Mrs3p und Mrs4p unter bestimmten Bedingungen für den Transport von Eisen in die Mitochondrien benötigt werden.