Immunologische Charakterisierung des Amb a 1 Allergens

Die Familie der Pektat-Lyasen spielt in der Allergie eine große Rolle. Vertreter wie Amb a 1, das Hauptallergen von Traubenkraut (Ragweed) Pollen stellen die Hauptquelle von allergischen Proteinen weltweit dar. Im Hauttest reagieren 90% aller Ragweed sensibilisierten Patienten mit Amb a 1 und rund 13% vom totalen Serum IgE sind gegen dieses Protein gerichtet. Amb a 1, ist eine Pektat-Lyase mit 38 kDa, die in zumindest vier verschieden Isoformen vorkommt. Obwohl die cDNA von Amb a 1 bereits 1991 von Rafnar und Kollegen isoliert wurde, fehlt immer noch eine Methode um Amb a 1 rekombinant, korrekt gefaltet und immunologisch aktiv, herzustellen. Aus diesem Grund gibt es auch noch keine zuverlässigen Daten über Struktur, B Zell oder T Zell Epitope von Amb a1 sowie geeignete Moleküle für eine moderne Diagnose und Therapie. Das Hauptziel dieses Projekts ist es, Amb a 1 als rekombinantes Molekül herzustellen, das eine vergleichbare immunologische Aktivität wie natürliches Amb a 1 aufweist. Dieses Ziel kann mit Hilfe von drei verschieden Stufen erreicht werden: (i) Herstellung eines immun-reaktiven rekombinanten Amb a 1; (ii) Design eines Hypoallergens von Amb a 1; (iii) und die Immunologische und Strukturelle Charakterisierung von Amb a 1 Kandidatenmolekülen im Bezug auf ihre Allergenizität. Dafür werden Methoden wie Random Mutagenesis und auch alternative Expressionssysteme wie Hefe-Kulturen und Tabak-Pflanzen eingesetzt. Des Weiteren planen wir die Wichtigkeit der einzelnen Amb a 1 Isoformen in Bezug auf deren IgE Reaktivität zu untersuchen. Alle Verbesserungen in Bezug auf rekombinant hergestelltes Amb a 1 sind Voraussetzung für eine effektive Diagnose und Therapie von Ragweed Pollen Allergie.

Traubenkraut (Ragweed, Ambrosia artemisiifolia) ist einer der Hauptauslöser von saisonalen Allergien in den Vereinigten Staaten, aber auch zunehmend in vielen Teilen Europas. Amb a 1, das Hauptallergen von Traubenkraut Pollen gehört zu der Proteinfamilie der Pektat-Lyasen und stellt die Hauptquelle von allergischen Proteinen weltweit dar. Vor mehr als zwei Jahrzehnten wurde Amb a 1 entdeckt und künstlich hergestellt und zählte somit zu den ersten beschrieben Allergenen. Während andere wichtige Allergene bereits rekombinant hergestellt wurden um neue Impfstoffe zu entwickeln, gibt es nur wenige Publikationen zur rekombinanten Herstellung von Amb a 1 und über die immunologische Reaktivität des rekombinanten Proteins. Deswegen liegt der Schwerpunkt dieses Projektes in der Herstellung eines rekombinanten Amb a 1 mit vergleichbarer IgE-Bindungskapazität zu dem natürlich aus dem Pollen isolierten Protein. Das rekombinante Protein ist wichtig um dieses Allergen immunologisch genau charakterisieren zu können und ein geeignetes Molekül für eine moderne Diagnose und Therapie für Ragweed Pollenallergie zu entwickeln. Zuerst versuchten wir Amb a 1 in Tabakpflanzen (pflanzliches Wirtssystem) und in Hefezellen künstlich herzustellen. Die Mengen an rekombinant hergestellten Amb a 1 in Hefezellen war sehr gering (nur im Immunoblot zu detektieren) und in Tabakpflanzen konnten keine Expression festgestellt werden. Deshalb änderten wir unseren Fokus und versuchten ein immunreaktives Amb a 1 mittels zufällig eingeführten Mutationen herzustellen. Amb a 1 wurde mittels random PCR mutiert und in E. coli exprimiert. Dabei wurde ein GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) angehängt um die Löslichkeit der Mutanten zu kontrollieren. Alle vielversprechenden Klone wurden weiter analysiert, aber wir waren dennoch nicht in der Lage ein lösliches voll-längen Protein herzustellen, das vergleichbare immunoreaktivität zeigt wie das natürliche Amb a 1. Deswegen stellten wir kürzere Versionen von Amb a 1 her, um sie auf Löslichkeit zu screenen und mehr Informationen über das Verhalten von Amb a 1 zu erhalten. Mit Hilfe der Protein Platform P-CUBE in Grenoble waren wir in der Lage tausende verschiedene Proteinfragmente auf ihre Löslichkeit zu testen. Wir konzentrierten uns nur auf die löslichen Klone, nachdem die Löslichkeit eines der größten Probleme in der künstlichen Herstellung von Amb a 1 ist. Alle Klone wurden sequenziert und die Sequenzinformationen wurden bioinformatisch analysiert. Die Sequenzanalysen von Amb a 1 zeigen eine komplexe Struktur mit mehreren Disulfidbrücken, die über die Speziesgrenzen hinaus streng konserviert ist.