Charakterisierung vom Nrl1 Protein in S. pombe: ein Link zwischen RNAi und Pol II?

Neueste Beobachtungen weisen darauf hin, daß es eine sowohl physische wie auch funktionelle Verbindung zwischen RNA Interferenz (RNAi) und RNA polymerase II (Pol II) in Eukaryonten gibt. Allerdings ist diese komplexe Beziehung in der Heterochromatinlandschaft von Metazoen noch nicht untersucht. In Caenorhabditis elegans, verbindet das NRDE-2 Protein RNAi und Pol II Inhibierung, in einem Prozeß welcher co- transcriptionelles Gensilencing (CTGS) genannt wird. Mittels Bioinformatik habe ich den Orthologen von C. elegans NRDE-2 in S. Pombe gefunden und dieses Gen "Nrde-2 Like Potrein 1" oder Nrl1 genannt. In diesem Projekt möchte ich gerne untersuchen ob und wie Nrl1 die Verbindung zwischen RNAi und Pol II in S. Pombe bewerkstelligt. Ich werde das Transkriptionsverhalten von Pol II in stillgelegten Loci untersuchen ob RNAi Faktoren und/oder Nrl1 selbst dieses Veralten beeinflussen. Um diese Fragen zu beantworten, möchte ich 1) die Funktion von Nrl1 sowohl im Wildtyp als auch im Nrl1 deletierten Stamm (Nrl) untersuchen um die physische Wechselwirkung und dessen funktionelles Wechselspiel mit der RNAi Machinerie im heterochromatin Gensilencing zu erörtern; 2) die Pol II Besetzung und Transkription in heterochromatischen Regionen messen, die von RNAi gezielt sind im Wildtyp, in RNAi Mutanten und in Nrl. Weil Nrl1 Orthologe in Arabidopsis, Drosophila und im Menschen vorhanden sind, wird dieses Projekt auch wichtige Beiträge für das RNAi-vermittelte CTGS in Metazoen beisteuern, die weit über das Hefesystem hinaus gehen, welches ich hier verwende.

In diesem Projekt haben wir das evolutionär konservierte Protein Nrl1 charakterisiert und seine Rolle für die Stabilität des Genoms entdeckt. Hierfür haben wir die Hefe Schizosaccharomyces pombe als Modelsystem verwendet. Unsere DNA ist ständig nicht nur Schädigungen durch Chemikalien aus der Umwelt ausgesetzt sondern auch durch fundamentale Prozesse, die für die Übersetzung der Information in Proteine wie zum Beispiel die Prozessierung der pre-mRNA notwendig sind. Die Unfähigkeit DNA Schäden zu reparieren ist eine bekannte Ursache für die Entstehung von Krebs, ebenso können Defekte in der pre-mRNA Prozessierung durch die Bildung von DNA-RNA Hybride, den sogenannten R-Schleifen, onkogenische Effekte haben. Es ist wahrscheinlich, dass Fehler in der DNA Reparatur und in der Prävention der R-Schleifen synergistisch zur Entstehung von DNA Schäden beisteuern. Es fehlte aber noch die direkte Evidenz für diese Behauptung. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Nrl1 physikalisch und funktionell mit pre-mRNA Prozessierungsfaktoren assoziiert und dass es effiziente DNA Reparatur garantiert und die Bildung von R-Schleifen unterdrückt. Unsere Ergebnisse unterstützen ein Model für einen neuen Mechanismus für die Entstehung von DNA Schäden, bei dem R-Schleifen Schlüsselenzyme der DNA Reparatur rekrutieren, wie zum Beispiel Rad51 und dadurch ihre Reparaturfunktion stören. Besonders wichtig ist die Tatsache, dass humane Zellen ein ähnliches Protein wie Nrl1 besitzen, dessen Expression in Krebszellen erhöht ist. Diese Arbeit legt den Grundstein um die Rolle dieses Proteins und anderer pre-mRNA Prozessierungsfaktoren in der DNA Reparatur und der R-Schleifen Bildung während der Krebsentstehung zu untersuchen.