Der tRNA ligase Komplex und seine Funktion in Neuronen

Unser Labor hat vor kurzem einen, in der Säugetier Zelle lange Zeit gesuchten Protein-Komplex, die tRNA Ligase, identifiziert. In Säugetieren, ist die tRNA Ligase ein Pentamer, das aus der katalytischen Untereinheit HSPC117, der DEAD box Helikase Ddx1 und drei Proteinen mit unbekannter Funktion - CGI-99, Fam98B und Ashwin- besteht. Das Spleißen von tRNAs ist in Zellen defekt, in denen die essentielle Untereinheit HSPC117 durch Transfektion von siRNAs depletiert wurde. Aufgrund der weitergehenden Funktionen der tRNA-Ligasen anderer Organismen glauben wir, dass dieser Komplex, abgesehen von tRNA Ligation auch zusätzliche Aufgaben in anderen RNA Prozessierungs- und RNA Stoffwechselwegen hat. Im Einklang mit dieser Hypothese konnten wir kürzlich zeigen, dass die Säugetier tRNA Ligase auch für das Spleißen von Xbp1 mRNA während der Unfolded Protein Response verantwortlich ist. RNA Prozessierungs-Enzyme spielen eine essentielle Rolle in Neuronen. Zusätzlich wurde die Anwesenheit von HSPC117 und dem restlichen tRNA Komplex in neuronalen Transport Granulaten beschrieben, die eine wichtige Rolle in neuronaler Entwicklung und der Aufrechterhaltung neuronaler Funktionen spielen. Wir wollen uns daher speziell auf die Rolle des tRNA Komplexes in Neuronen konzentrieren. Um die in vivo Funktion der Säugetier tRNA Ligase genauer zu erforschen, habe ich kürzlich ein HSPC117 Knockout-Maus Modell etabliert. Da der komplette Knockout von HSPC117 zu früher embryonaler Letalität führt, war es nicht möglich diese Mäuse bezüglich möglicher neuronaler Defekte zu analysieren. Daher habe ich zusätzlich einen Neuronen-spezifisches Knockout Maus Modell aufgestellt - HSPC117fl/fl Nestin-Cre. Ich möchte dieses Maus Modell detailliert phänotypisch charakterisieren (Aim 1). Dazu werde ich histologische und immunhistochemische Analysen von Gehirn und Rückenmark durchführen um potentielle Defekte dieser Mäuse in der neuronalen Entwicklung, Morphologie und dem Überleben der Neuronen zu bewerten. Ich möchte dieses Maus Modell auch dazu verwenden den molekularen Mechanismus, der diesen Defekten zugrunde liegt näher zu beschreiben (Aim 2). Dafür werde ich die Differenzierung und Funktion der Neuronen dieser Mäuse mittels biochemischer, Immunfluoreszenz- und quantitative Echtzeit-Bildgebungs- Techniken analysieren. Ich glaube, dass die Resultate dieser Studie zu neuen funktionellen Erkenntnissen im Gebiet der RNA Ligation und Neurobiologie beitragen werden. RNA-Ligation und RNA-Ligase Enzyme in Säugetieren sind relativ unerforscht. Die in diesem Antrag beschriebenen Experimente, durchgeführt mit fortschrittlichen und zeitgemäßen Techniken, werden grundlegende Einblicke in RNA Ligation und die Funktion von RNA Ligasen in unterschiedlichen zellulären Prozessen liefern und möglicherweise dazu beitragen Störungen in diesen Mechanismen mit neuronalen und anderen Erkrankungen in Verbindung zu bringen.

Es ist bekannt, dass die Aktivität der Säugetier-RNA-Ligase-RTCB für das Spleißen von tRNA Introns wichtig ist. In diesem Projekt konnten wir zusätzlich eine weitere Funktion dieses Proteins beschreiben. Wir haben gezeigt, dass RTCB zusammen mit dem Co- Faktor Archease das unkonventionelle RNA-Spleißen der Xbp1-mRNA katalysiert, die eine wichtige Rolle im Unfolded Protein Resonse (UPR) spielt. Zusätzlich zur Funktion im Spleißen von tRNAs und der Ligation der Xbp1-mRNA wurde die Anwesenheit von RTCB auch in neuronalen RNA-Granules beschrieben, die mRNAs in Axone und Dendriten transportieren. Diese Granules spielen eine wichtige Rollen bei der Regulation der lokalen Translation, einen Prozess der wichtig für die Bildung von Erinnerungen sowie die neuronale Entwicklung ist. Eine Bedeutung von RTCB in Neuronen wurde bislang nicht beschrieben. Das Hauptziel des Projektes war es daher, die Rolle von RTCB in diesem Zusammenhang zu untersuchen. Zu diesem Zweck etablierten wir zwei Mausmodelle: Rtcbfl/fl Nestin-Cre-Mäuse, in denen Rtcb während der Embryogenese in neuronalen Vorläuferzellen deletiert wird und Rtcbfl/fl Camk2a-Cre-Mäuse in denen Rtcb nach der Geburt in post-mitotischen Neuronen ausgeschalten wird. Wir konnten zeigen, dass die Abwesenheit von RTCB während der neuronalen Entwicklung einen frühen postnatalen Tod verursacht. Obwohl das Fehlen von RTCB während der Entwicklung die allgemeine Gehirnmorphologie nicht beeinträchtigte, führte sie zum Verlust von Neuronen in bestimmten Hirnregionen wie beispielsweise im Riechkolben, in der Großhirnrinde und dem Kleinhirn. Diese Defekte werden nicht durch das Fehlen von reifen tRNAs oder schwerwiegenden Defekten in der Protein Translation verursacht. Stattdessen postulieren wir, dass das Fehlen von RTCB Defekte in neuronalen Vorläuferzellen verursacht, die die Proliferation dieser Zellen und ihre Differenzierung zu postmitotischen Neuronen beeinflussen. Unter Verwendung des Rtcbfl/fl Camk2a-Cre - Mausmodells zeigten wir ferner, dass die Abwesenheit von RTCB in adulten Neuronen zu einer erhöhten synaptischen Signalübertragung führt, die letztendlich synaptische Dysfunktion und Neurodegeneration auslöst. Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass RTCB neben dem tRNA-Spleißen und dem UPR auch mehrere andere essentielle Prozesse beeinflusst und dass die Abwesenheit von RTCB in Neuronen pleiotrope Effekte hat, die sich sowohl auf die Neurogenese als auch neuronale Funktionen auswirken.