Die Funktion von Golgi N-Glykosylierungs-Enzymkomplexen

Der Golgi-Apparat ist das zentrale biosynthetische Organell des sekretorischen Wegs und spielt daher in allen eukaryotischen Zellen eine entscheidende Rolle beim Transport und der gleichzeitigen Modifikation von Proteinen und Polysacchariden. Die schrittweise Modifizierung von N-glykosidisch an Proteine gebundenen Oligosacchariden (N-Glykane) im Golgi-Apparat gleicht einer Fließbandarbeit und ist das Ergebnis von mehreren sequentiell arbeitenden Glykosidasen und Glykosyltransferasen, die asymmetrisch über die cis-, medialen und trans-Zisternen des Golgi-Stapels verteilt sind. Es wird allgemein angenommen, dass die streng kontrollierte Verteilung der Golgi- ansässigen Enzyme in verschiedene Zisternen für die Funktionalität des Golgi-Apparats entscheidend ist. Wie diese asymmetrische Verteilung innerhalb des Golgi-Stapels etabliert und aufrechterhalten wird, ist derzeit jedoch nicht bekannt und die Mechanismen, welche die Organisation von Golgi-Enzymen und deren Interaktion mit Makromolekülen regulieren, sind unklar. Durch die Verwendung der nicht-invasiven biophysikalischen FRET- FLIM Methode entdeckten wir vor Kurzem, dass mehrere N-Glykosylierungsenzyme, die frühe Prozessierungsschritte in cis-seitigen Zisternen des Golgi-Stapels katalysieren, homo- und heterodimere Komplexe in der Pflanzenzelle bilden. Wir vermuten, dass die Komplexbildung von einzelnen Enzympopulationen mittels Protein-Protein-Interaktionen eine funktionelle Relevanz für die kompartimentspezifische Golgi (Protein)- Organisation hat bzw. als ein Werkzeug zur Regulation der N-Glykan-Prozessierung dient. Ziel dieses Projekts ist die Charakterisierung eines N-Glykosylierungs-Enzymkomplexes, der sich in den cis/medialen-Zisternen des pflanzlichen Golgi-Apparats befindet. Wir werden komplementäre zellbiologische, genetische, biochemische und proteomische Ansätze verwenden, um die biologische Rolle dieses Enzmykomplexes für die Entwicklung und Physiologie von Pflanzen zu identifizieren sowie seine funktionelle Bedeutung für die Erhaltung der normalen Golgi-Funktionen, wie die spezifischen Glykosylierungsereignisse in Pflanzenzellen, zu enträtseln. Um eine mögliche Bildung eines Multi-Enzymkomplexes untersuchen zu können, werden wir eine Methode entwickeln und anwenden, mit der mittels dreifärbigem FRET in Kombination mit Multiphotonen- induziertem FLIM gleichzeitig mehrere Interaktionen im selben Organell sichtbar gemacht werden können. In Summe werden diese Experimente die Zusammensetzung und biologische Bedeutung des identifizierten Enzymkomplexes erläutern und uns neue Einblicke in die strukturelle und funktionelle Organisation des Golgi- Apparats in Pflanzenzellen ermöglichen.

Der pflanzliche Golgi-Apparat ist ein wichtiges zelluläres Organell, das aus einzelnen Stapeln membranumschlossener Hohlräume besteht. Die Hohlräume sind mit Enzymen gefüllt, die Zuckerketten von z.B. Proteinen modifizieren (Glykosylierung). Ziel dieses Projektes war es, einen Golgi-lokalisierten Proteinkomplex in Pflanzen zu charakterisieren, welcher aus drei verschiedenen Glykosylierungsenzymen besteht. Mit Hilfe von zellbiologischen, genetischen und biochemischen Methoden sollte die biologische Rolle bzw. funktionelle Bedeutung dieses Enzymkomplexes für die Erhaltung der normalen Golgi-Funktionen, wie die Modifikation von Zuckerketten, und die Entwicklung der Pflanze generell untersucht werden. Dafür wurden die Modellpflanzen Nicotiana sp. und Arabidopsis thaliana herangezogen. Eine der ersten Erkenntnisse war, dass eine einzelne Aminosäure in der Membrandomäne eines wichtigen Enzyms namens GnTI, eine Glykosyltransferase, die die Herstellung von komplexen Zuckerketten kontrolliert, für seine Positionierung innerhalb des Golgi-Stapels verantwortlich ist. Die luminale Domäne dient währenddessen der Interaktion mit sich selbst und anderen Glykosylierungsenzymen. Weiters entwickelten wir eine nicht- invasive mikroskopische Methode namens 2-Farben FRET-FLIM, um in lebenden Zellen mehrere Proteininteraktionen im gleichen Organell zeitgleich sichtbar machen zu können. Im Zuge des Projektes wurde diese Methode in Kombination mit humanen Zellen erfolgreich implementiert und wird aktuell für die Anwendung an Pflanzenzellen adaptiert, um den Aufbau des oben genannten Golgi-lokalisierten Enzymkomplexes vollständig aufklären zu können. Die Charakterisierung des Interaktoms von GnTI zeigte außerdem eine Interaktion mit einer ER-alpha-Mannosidase namens MNS3 auf, welche aufgrund eines spezifischen Aminosäure-Signals im Golgi Apparat zurückgehalten wird. Dieses Signal ist keinem der bis jetzt bekannten Lokalisationssignale in Pflanzen, Säugetieren und Hefen ähnlich. Es ist dafür verantwortlich, dass im Endoplasmatischen Retikulum (ER) der Abbau von inaktiven Glykoproteinen, welche das Überleben der Zelle gefährden, nicht durch die Anwesenheit und Aktivität von MNS3 im ER gestört werden.