Puls EPR der Dynamik katalytischer Aminosäuren in Hämenzymen

Hämproteine steuern eine Vielzahl an verschiedenen biologischen Funktionen wie z.B. den Sauerstofftransport, - speicherung und reduktion, den Elektronentransport und die Oxidation organischer und anorganischer Verbindungen. Zur Aufklärung der katalytischen Mechanismen ist neben der Kenntnis der räumlichen und elektronischen Struktur der relevanten Redox-Intermediate auch die Dynamik der an der Reaktion beteiligten Aminosäuren essentiell. Sehr oft sind aktive Seitenreste mobil und können in verschiedenen räumlichen Konformationen bzw. Orientierungen vorliegen. In den meisten Fällen ist die Beziehung zwischen bestimmten Konformationen und der Funktion jedoch noch unklar. Dieses Projekt konzentriert sich erstmals auf die Aufklärung der Bedeutung von solchen mobilen Argininen anhand der Modellenzyme Chlorit Dismutase (Cld) und Katalase- Peroxidase (KatG). Die rekombinante Herstellung dieser Enzyme ist im Labor vom Mitantragsteller gut etabliert. Die Arg-Konformation wird in Abhängigkeit der Hämreaktivität als auch der Stabilität und Umwandlung von Redoxintermediaten mittels Elektronen Paramagnetischer Resonanz (EPR) Spektroskopie untersucht, wobei spezielle Puls EPR Techniken wie HYSCORE und Puls-ENDOR zur Anwendung kommen. Die Proteine werden unter verschiedenen Bedingungen wie pH, Ionenstärke, Spin-, Koordinations- und Oxidationszustand als auch unter bestimmten Isotopen-Markierungen (der Aminosäuren und/oder der prosthetischen Gruppen) untersucht. Puls- ENDOR und HYSCORE sind komplementäre Techniken zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen dem ungepaarten Elektron und den umgebenden Kernen mit einem Spin 0. Bislang sind nur wenige Anwendungsbeispiele dieser Methoden in der biophysikalischen Analyse der Hämenzyme bekannt. In den gewählten Modellenzymen kommen bewegliche Argenine vor, die sich in der Nähe des aktiven Zentrums befinden und zumindest zwei Konformationen annehmen können. Da das Fe-Zentrum von zusätzlichen N-Atomen umgeben ist, ist für zur Vereinfachung der Interpretation der Spektren ein 14N/15N Isotopenaustausch und Puls-ENDOR geplant. Die Katalase-Peroxidase hat eine Arg-Gruppe, deren Konformationsänderungen Auswirkungen auf eine außergewöhnliche posttranslationale Modifikation, ein KatG-typisches redoxaktives Trp-Tyr-Met Addukt, hat. Durch die unterschiedliche Orientierung dieses mobilen Arg ändert sich der elektronenschiebende und ziehende Effekt auf das Hämzentrum und damit auf die Reaktivität. Weiters entsteht in diesem Enzym ein transientes Tyr- Radikal am Addukt, das für die Aktivität des Enzymes wichtig ist und im Zuge dieses Projektes ebenfalls mit Puls- ENDOR und HYSCORE untersucht wird. Die Verwendung von Puls-EPR Techniken innerhalb dieses Projekts soll neue mechanistische Erkenntnisse über die Funktion von mobilen Aminosäuren in Hämproteinen liefern.