Intrazell. Ca2+ Verteilung unter pathologischen Bedingungen

Das Endothel ist ein wichtiger Regulator des Stoffwechsels zwischen Blut und Muskelzellen und senkt den Widerstand der Blutgefäße. In Endothelzellen werden verschiedene Faktoren freigesetzt, die Relaxation und Kontraktion des Blutgefäßes regulieren. Endothelzellen spielen eine wichtige Rolle in der Modulation sowahl der Immunantwort als auch den aus Herzerkrankungen oder Risikofaktoren folgenden Abnormitäten des vaskulären Tonus. Diese Funktion der Endathelzellen ist auf die Änderung der Ca2+ Konzentration zurückzuführen. Zahlreiche Membranproteine und Enzyme werden durch das von den intrazellulären Speichern freigesetzte Ca2+ aktiviert. Des Endothel ist aber auch ein Ziel der freien Radikale. Die Oxidationsprodukte können die Fähigkeit der Endothelzellen, Stickstoffoxid (NO) und anderen Relaxations- / Kontraktionsfaktoren freizusetzen, zerstören. Diese Beschädigung der Zellmembran ist der erste Schritt zur Atherosklerose. Die Rolle des durch Glycooxydation / Lipoxidation entstehenden oxidativen Stresses hat eine verbreitete Akzeptanz gewonnen. Bis jetzt wurde die Reaktion der Zelle auf hohe Glucose / Cholesterin Konzentration nicht genau beschrieben. In diesem Projekt wird ein neuer Aspekt des Ca2+ Signals untersucht. Das Projekt sollte mehrere Fragen beantworten, die die Verteilung des subplasmalemmalen und cytosolischen Ca2+ in Endothelzellen mit erhöhter Glucose / Cholesterin Konzentration betreffen. Die Änderungen in der Ca2+ Konzentration werden dank einer neuen Methode, die wir anwenden wollen, sichtbar gemacht. Die Änderungen sowohl in der intrazellulären Ca2+ Konzentration als auch in der Ca2+ - Verteilung werden simultan mit Hilfe der Fluoreszenzmethode und Deconvolution Mikraskopie in Endothelzellen gemessen. Es wird die Aktivierung der subplasmalemmalen und intrazellulären Enzyme gemessen, korreliert mit der endothelialen Dysfunktion während Hypercholesterolemie, Diabetes Mellitus oder während beider Krankheiten (Atherosklerose bei Diabetikern). Diese Studie sollte ein neues Verständnis der Aktivierung der intrazellulären / subzellulären Kompartimente und deren Sensitiviät während der oben erwähnten Erkrankungen bringen. Die geplanten Untersuchungen werden in drei Schritten durchgeführt: 1) Einfluß der erhöhten Glucose Konzentration auf humane Endothelzellen wird durch die Untersuchung von Transmembransignalen, Ca2+ - Oszillationen, subplasmalemmaier Ca2+ Freisetzung von intrazellulären Speichern, Ca2+ - Verteilung und Lokalisierung des Golgi Apparatus, des Endoplasmatischen Reticulum und der Mitochandrien gezeigt. 2) Effekt der Anreicherung der LDL (low density lipoprotein) oder der oxidierten LOL (oxLDL) auf die Membranordnung. Durchgeführt werden Messungen der subplasmalemmelen und zytosolischen Ca2+ - Verteilung, Ca2+ - Oszillationen, Aktivierung der subzellulären Ca2+ - Speicher (z.B. Ryanodin - Speicher) und Ca2+ - Gradienten. 3) Einfluß von diabetischen Bedingungen in der Atherosclerose auf die endotheliale Dysfunktion, auf die Änderungen des intrazellulären Ca2+ Signals, auf die Architektur des subplasmalemmalen Bereiches, Lokalisierung der intrazelluliren Kompartimente und auf die Aktivität der irtrazellulären / subplasmalemmalen Speicher ( Ryanodin -, IP3 - Speicher). In dem vorliegenden Proiekt werden räumlich und zeitlich aufgelöste Messungen der lokalen Ca2+ - Konzentration in frisch isolierten Endothelzellen / Muskelzellen von Diabetikern oder von Hypercholesterolemikern durchgeführt. Digitale Bildaufbereitung, Deconvolution Technik und 2D / 3D Rekonstruktion erlauben die Bestimmung der intrazellulären / subzellfulären Ca2+ - Konzentration und Ca2+ -Verteilung in zellulären Kompartimenten unter normalen und pathologischen Bedingungen. Hier wird gezeigt, daß nicht nur die Änderungen in der Zellmembran sondern auch die Teilzerstörung des Endoplasmatischen Retikulums und die Unterbrechung der Verbindung zwischen den subplasmatemmalen Kompartimenten und den Membrankanälen der Anfang der Zellschäden sind. Die räumliche Auflösung der Fluoreszenzbildaufbereitung bietet viele Vorteile für die Studie der Verteilung von Ionen und Macromaleküle und für die dreidimensionale Darstellung der Organisation intrazellukärer Organellen.