Die biochemische Grundlage der PAR Polarität

Mehrzellige Organismen, wie der Mensch, sind ein Mosaik aus vielen verschiedenen Zelltypen die bestimmte Aufgaben übernehmen. Sie entstehen durch asymmetrische Zellteilung, bei der sich Moleküle innerhalb der Zelle asymmetrisch anordnen. Dies wird in der Zellbiologie unter Polarität verstanden. Die Tochterzellen dieser Zellteilung unterscheiden sich hinsichtlich Grösse, Inhalt und/oder Entwicklungspotential. Am besten untersucht ist die zelluläre Polarität im Embryo des Fadenwurms Caenorhabditis elegans. Vor der ersten Zellteilung verteilen sich die sogenannten PAR (partitioning defective) Proteine asymmetrisch entlang der Zellmembran und etablieren dadurch zwei komplementäre Domänen. In mehr als 25 Jahren Forschungsarbeit auf diesem Gebiet sind etliche PAR Proteine entdeckt und charakterisiert worden. Mittlerweile ist bekannt, dass mehrere PAR Proteine sich vorübergehend zu Protein-Ensembles auf der Zellmembran zusammenschliessen. Je nach Protein-Identität sind sie dem anterioren PAR Komplex zugehörig, der sich am vorderen Ende des Embryos befindet, oder Teil des posterioren PAR Komplex, der die hintere Domäne des Embryos einnimmt. In der Mitte des Embryos zwischen den zwei Domänen, treffen die Protein-Komplexe aufeinander und lösen den jeweils anderen Komplex von der Zellmembran ab, sodass dieser dann gelöst im Zytoplasma vorliegt. Dieses gegenseitige Ausschliessen von der Zellmembran ist das Fundament von zellulärer Asymmetrie und Polarität. Bis heute wissen wir nicht genau, was im Detail dazu führt, dass die Proteinkomplexe die Zellmembran verlassen. Um diese Wissenslücke zu schliessen, werden wir die PAR Proteine einzeln und als Ensembles genau charakterisieren und ihre molekularen Eigenschaften bestimmen. Ziel dieses Projekts ist es die PAR Proteine aufzureinigen, um damit den Vorgang der Polarisierung ausserhalb der lebenden Zelle nachzubauen. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie werden wir die Interaktionen zwischen den PAR Proteine und einer Lipidmembran analysieren. Auf diese Weise beobachten wir, wie die PAR Proteine Muster auf der künstlichen Zellmembran formen, analog zur Domänenbildung im Embryo. Mit dem hier vorgeschlagenen Versuchsaufbau werden wir in der Lage sein, aus den gewonnenen Informationen Rückschlüsse auf den generellen Mechanismus der Entstehung von Polarität zu ziehen. Wir sind überzeugt, dass unser in vitro Ansatz die bestmögliche Herangehensweise darstellt, um das PAR System zu verstehen. Diese Arbeit befasst sich mit einer der wichtigsten Fragen der Zell- und Entwicklungsbiologie: wie interagieren Proteine, um eine lebende Zelle hervorzubringen und letztendlich einen ganzen Organismus entstehen zu lassen.

Im Verlauf dieses Projekts war es uns möglich die biochemischen Grundlagen zur Analyse der PAR Proteine herauszuarbeiten. Die PAR Proteine sind verantwortlich für die erste asymmetrische Zellteilung in der Zygote des Wurms C.elegans. Wir haben eine ausführliche Beschreibung der Aufreinigung von 6 Membranproteinen zusammengestellt. Die sogenannten PAR Polaritäts-Proteine spielen eine essentielle Rolle in der Organisation zweier, sich ausschließenden Membrandomänen. Die Zygote erkennt anhand dieser Membrandomänen ihre Polaritäts-Achse und teilt sich asymmetrisch entlang der Achse. Das Resultat dieser Zellteilung sind 2 Tochterzellen mit unterschiedlichem Inhalt (RNAs, Proteinen) und Schicksal.Ziel unserer Arbeit war die Rekonstruierung (im Sinne von Nachbau) des PAR Polaritätsnetzwerks, sowie isolierter elementarer Bestandteile des Netzwerkes, in vitro. Eine solche Rekonstruierung der in vivo Situation erlaubt es, die biochemischen Reaktionen die der PAR Polarität zugrunde liegen zu verstehen. Um dies zu erreichen war es notwendig Protokolle für die Aufreinigung der PAR Proteine zu etablieren. Generell ist es kompliziert membran-bindende Proteine so aufzureinigen, dass sie nicht aggregieren und trotzdem in ihrer nativen, funktionalen Form vorliegen. Wir konnten für alle 6 Polaritätsproteine Bedingungen finden und Protokolle etablieren um die Proteine erfolgreich aufzureinigen. Dies ermöglichte es uns dann die Aktivitaet in vitro zu testen mittels Liposomen-Bindungs Assays, wobei die Liposomen (Lipidvesikel) als Membranersatz in vitro dienen. Dieses minimalistische Rekonstituierungssystem (PAR Proteine und Lipide) erlaubt das systematische Testen von Membranbindung und Membrandiffusion einzelner PAR Proteine, sowie jeglicher Kombination. Im Rahmen dieses Projektes haben wir die wichtigsten Komponenten der PAR Polarität aufgereinigt in ausreichender Menge und Reinheit. Dies wurde durch mehrere Optimierungsprozesse erreicht, wobei Expressionsorganismus, die Expressionsbedingungen und Aufreinigungsbedingungen rigoros getestet wurden. Die Mehrheit der PAR Proteine wurde von Baculovirus infizierten Insektenzellen überexprimiert und aus deren Membran mit Hilfe von Detergenzien isoliert. Im Anschluss wurde die Identität der Proteine mit Massenspektroskopie validiert und funktionale Assays, wie Kinase-Assays oder Liposomen-Bindungs-Assays, wurden durchgeführt (detaillierte Ergebnisse siehe part II). Abschließend ist zu sagen, dass wir die biochemischen Protokolle für eine systematische Analyse der PAR Proteine etabliert haben und erste biochemische Analysen durchgeführt haben.