TERT Promoter Mutationen und Tumoraggressivität

Die Telomerstabilisierung ist ein Merkmal vieler Tumorzellen und unabdingbar für permanente Zellteilung und Wachstum. Folglich aktiviert die Mehrzahl aller Krebsarten, so auch Glioblastome (GBM) und maligne Pleuramesotheliome (MPM), das Enzym Telomerase. Die Entdeckung von nicht kodierenden Mutationen im Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) Promoter hat die Aktivierung von Telomerase in Krebszellen in das Zentrum aktueller Forschung gerückt. Mehrere Studien, so auch eine aus unserer Gruppe, zeigten einen Zusammenhang von TERT Promotermutationen und erhöhter TERT Expression verbunden mit einer signifikant schlechteren Prognose für GBM- und Melanompatienten. Interessanterweise aktiviert jedoch auch die Mehrzahl aller Tumoren mit TERT wildtyp Promoter das Enzym Telomerase. Dies führt zur Annahme, dass TERT Promotermutationen noch zusätzliche onkogene Eigenschaften abseits der Telomerverlängerung haben, deren Mechanismen aber immer noch weitgehend unbekannt sind. Deshalb geht das Projekt der Hypothese nach, ob Veränderungen in der TERT-Promotersequenz und die daraus resultierende TERT Überexpression unabhängig vom Ursprungsgewebe einen aggressiveren Tumorzelltyp forcieren. Es wird überprüft, ob die Interaktion zwischen Promotermutationen und einem benachbarten Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP; rs2853669) einen Einfluss auf die Aggressivität von GBM- und MPM- Zellen hat. Weiters stellen wir die Hypothese auf, dass TERT Promotervarianten die sekundäre Struktur der DNA verändern und dadurch die Sensitivität von malignen Zellen gegenüber promoter-targeting Verbindungen (G-Quadruplex- Stabilisatoren) beeinflussen. Um dies zu validieren, wird die TERT Promoteraktivität mittels gentechnisch veränderten Reporterkonstrukten in GBM und MPM analysiert. All diese Versuche werden einerseits in Zelllinien mit unterschiedlichen endogenen TERT Promotervarianten durchgeführt. Andererseits werden auch isogene TERT Promoter wildtyp versus mutierte Zelllinien mittels CRISPR/CAS9 Technologie hergestellt und analysiert. Zur Erforschung von Mechanismen welche die Promoterüberaktivierung begünstigen, wird die Bindung von Transkriptionsfaktoren (TF) an wildtyp und mutierten TERT Promotoren in GBM Zelllinien und isogenen Modellen verglichen. Die vielversprechendsten TF werden inhibiert und die Auswirkung auf die Telomeraseaktivität, sowie auf die Zellaggressivität untersucht. Des Weiteren erforscht das Projekt die nicht-kanonischen Funktionen des TERT Gens in Promoter wildtyp und mutierten GBM Zellen. Mittels in silico Analysen sollen Veränderungen der Expressionsmuster von TF und nicht-kanonischen Molekülen bestätigt werden. Schließlich wird der Einfluss des TERT Promoterstatus auf die Sensitivität gegenüber Telomeraseinhibitoren in vitro und in vivo getestet. Zusammengefasst soll das Projekt aufklären, welche regulatorischen Mechanismen die Überaktivierung des TERT Promoters begünstigen und somit zur Aggressivität in mutierten und wildtyp GBM und MPM Zellen beitragen. Die gewonnenen Resultate sollen unser Verständnis dafür vertiefen, inwieweit die erhöhte Malignität eine Konsequenz der robusten Telomerstabilisierung, der verstärkten nicht-kanonischen TERT- Funktionen, oder eine anderer Art der malignen Transformation getrieben durch den TERT Promoter Mutationsstatus darstellen. Das erlangte Wissen soll die Entwicklung von neuen Therapiestrategien zur Bekämpfung von immortalisierten Krebszellen forcieren.

Immortalisierungsmechanismen sind Haupttreiber der bösartigen Transformation in verschiedenen Tumorarten, einschließlich hochgradiger Hirntumore und dem malignen Pleuramesotheliom. So sind bis zu 90% dieser Malignome durch unbegrenzte Zellteilung und Unsterblichkeit gekennzeichnet, hauptsächlich basierend auf der Reaktivierung der Telomerase. In diesem Sinne hatte dieses Projekt zum Ziel, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Aggressivität von durch Telomerase getriebenen hochgradigen Hirntumoren und malignem Pleuramesotheliom vorantreiben. Generell wollte das Projekt den Einfluss der Mechanismen der Unsterblichkeit, insbesondere der Telomerase-Reaktivierung durch TERT-Promotor Mutationen oder epigenetische Mechanismen, auf die maligne Zelltransformation sowie auf Stammzellmerkmale klären, und dieses Wissen in neuartige therapeutische Interventionen umsetzen. Wir konnten zeigen, dass progressive bösartige Meningeome sowie das maligne Pleuramesotheliom häufig TERT-Promotor Mutationen aufweisen, die die Prognose der Patient:innen bei diesen Tumorarten negativ beeinflussen. Im Fall von Meningeomen konnten wir diese treibende Mutation erfolgreich mit einem ETS-Faktor Inhibitor in präklinischen Zellmodellen blockieren. Vergleichbare Ergebnisse wurden für bösartige BRAFV600E-mutierte hochgradige Gliome erzielt. Im Detail fanden wir heraus, dass die Bindung des Transkriptionsfaktors ETS1 die Reaktivierung der Telomerase vorantreibt, was durch einen ETS-Inhibitor blockiert werden kann. Darauf basierend nehmen wir an, dass Substanzen, die ETS1 inhibieren, als innovative personalisierte therapeutische Behandlungsstrategie für TERT-Promotor-getriebene Meningeome und BRAF-veränderte hochgradige Gliome in Betracht gezogen werden können. Da unsere Daten bereits zeigten, dass die replikative Unsterblichkeit durch die Reaktivierung der Telomerase ein Haupttreiber von stammzellähnlichen Eigenschaften beim Ependymom ist, haben wir genetische und epigenetische Mechanismen untersucht, die diese Stammzellmerkmale bei Hochrisikogruppen des Ependymoms aufrechterhalten. Basierend auf Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalysen von ependymalen Tumoren haben wir festgestellt, dass Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptoren (FGFR) in undifferenzierten, stammzellähnlichen Subpopulationen angereichert sind. Die genetische oder pharmakologische Hemmung der FGFR-Signalkaskade beeinträchtigte das Überleben der Ependymomzellen und löste zelluläre Differenzierung aus. Basierend auf unseren präklinischen Ergebnissen wurde ein pädiatrischer Patient mit fortschreitendem malignem Ependymom mit einem FGFR-Inhibitor behandelt, was zu einem stabilen Krankheitsverlauf über mehrere Monate führte. Aufgrund dieser Daten gehen wir davon aus, dass Therapieansätze, die Differenzierung induzieren, neuartige Behandlungsoptionen für Hochrisiko-Hirntumoren bei Kindern darstellen. Im Fall des Glioblastoms wurde ein synergistischer Effekt zwischen FGFR- und Integrin/Fokaladhäsionskinase-Inhibition beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Kombinationstherapie als neuartiges therapeutisches Konzept bei "FGFR4-hohen" Glioblastompatient:innen darstellt. Zusammenfassend hat dieses Projekt umfassend den Einfluss der Telomerase-Reaktivierung auf die Prognose der Patient:innen untersucht und erste Hinweise darauf gegeben, dass TERT ein neuartiges geeignetes Therapietarget in aggressiven Hirntumoren darstellt. Parallel dazu haben wir die biologische Komplexität stammzellähnlicher Eigenschaften aufgedeckt, die durch veränderte Telomerase- und FGFR-Signalaktivierung vorangetrieben werden, und dieses Wissen in innovative präklinische Behandlungsansätze für Hochrisiko-Hirntumoren umgesetzt.