Regulation des Zytoskeletts durch Kinasen der DMPK-Familie

Um auf verschiedene äußere Umstände reagieren zu können, zu wachsen und sich zu vermehren, müssen Zellen in der Lage sein, ihre Form zu verändern. Eine fundamentale Rolle spielt dabei das Aktomyosin- Zytoskelett der Zelle, das die Veränderung der Form möglich macht. Die Fortbewegung von Zellen, die Anheftung von Zellen, die Zellteilung und z.B. der Transport von Vesikeln beruhen auf der Umgestaltung des Zytoskeletts. Für krankhafte Prozesse wie die Metastasierung von Krebszellen und die Degeneration von Nervenzellen ist ein Zusammenhang mit einer Dysfunktion des Zytoskeletts beschrieben worden. Zellen müssen dabei in der Lage sein Reize, die außerhalb der Zelle vorliegen, wahrzunehmen und über die Plasmamembran ins Innere zu leiten, um dort entsprechende Signalketten auszulösen. Die Familie der DMPK-Kinasen umfasst wichtige Enzyme, wie ROCK und MRCK, die an dieser Signalweiterleitung beteiligt sind. ROCK und MRCK werden dabei von Lipiden, kleinen GTPases und verschiedenen Adaptoren an der Membran lokalisiert und phosphorylieren daraufhin Effektormoleküle, was die Umgestaltungen des Zytoskeletts zur Folge hat. Für ROCK konnten wir die Struktur lösen und die Konformation und enzymatischen Eigenschaften beschreiben. Die Kinase Domäne, die die enzymatische Funktion ausübt und die regulatorischen Domänen sind dabei über eine 107 nm lange Spiralkette miteinander verbunden. Diese Spiralkette funktioniert wie ein molekulares Maßband und eine Kürzung dieses Maßbandes beeinträchtig die Umgestaltung des Zytoskeletts. Das stellt eine völlig neue Art der Regulierung von Aktivität dar. Wir nehmen an, daß unser neues Model der Regulierung auf andere DMPK-Kinasen übertragbar ist und die Regulierung der DMPK-Kinasen über einen gemeinsamen Mechanismus erfolgt. Wir möchten daher in diesem Proposal die Struktur, Konformation und enzymatischen Funktionen von MRCK studieren. Für eine effektive Phosphorylierung durch ROCK und MRCK ist es dabei auch von entscheidender Bedeutung, daß beide Kinasen an spezifischen Membranstellen platziert werden. Obwohl die korrekte Platzierung von wesentlicher Bedeutung ist, sind die Bindepartner für ROCK und MRCK bis heute nicht beschrieben worden. Wir werden einen hochmodernen Assay verwenden, der es erlaubt mit hohem Durchsatz viele Bindepartner zu testen und die Bindung zu quantifizieren. Parallel dazu möchten wir die Struktur der membran-bindenden Domänen von MRCK aufklären. Das Wissen über die spezifischen Bindepartner und den 3-dimensionale Aufbau der Domänen wird es uns erlauben, Rückschlüsse auf die spezifische Lokalisation zu ziehen, eine der wichtigsten Fragen in Bezug auf die Arbeitsweise dieser Kinasen. Um außerdem die Lokalisation und Konformation von ROCK und MRCK direkt in Zellen zu studieren, werden wir neueste hochauflösende Mikroskopiertechniken verwenden und dabei von zwei Experten-Laboren in Deutschland unterstützt werden. Insgesamt werden wir biophysikalische, biochemische und zellbiologische Techniken verwenden, um mit den in diesem Proposal dargestellten Experimenten wichtige Fragen zur Signalweiterleitung durch die Kinasen ROCK und MRCK zu beantworten und zu erforschen, wie das Zytoskelett der Zelle reguliert wird.

Kinasen sind wichtige Enzyme die, durch die Phosphorylierung verschiedener nachgeschalteter Moleküle, die Zelle befähigen auf Umwelteinflüsse zu reagieren und dabei helfen lebenswichtige Signalwege wie Wachstum, Überleben, Bewegung und Transport zu regulieren. Pathophysiologische Prozesse wie die Metastasierung von Krebszellen oder die Neurodegeneration werden mit einer Funktionsstörung von Kinasen in Verbindung gebracht. ROCK und MRCK, sind zwei Proteinkinasen der AGC Familie und übersetzen verschiedene Membran-basierte Signale von Lipiden oder anderen Proteinen in die Phosphorylierung nachgeschalteter Effektoren die ihrerseits die Kontraktilität des Aktomyosins modulieren und der Zelle erlauben ihre Morphologie entsprechend ihrer Bedürfnissen zu ändern. In einer früheren Studie haben wir die Volllängenstruktur von ROCK2 beschrieben und dargelegt, daß die Kinasedomäne und die regulatorischen Domänen über eine 107 nm lange Doppelwendel verbunden sind. Die Doppelwendel funktioniert als molekulares Maßband und die Phosphorylierung der Substrate durch ROCK hängt von der korrekten Länge der Doppelwendel ab. Interessanterweise sind die Kinasedomäne und die Membran-bindenden Domänen von MRCK in der gleichen Weise über eine Doppelwendel verbunden. Auch diese Doppelwendel ist in ihrer Länge konserviert. In der hier vorliegenden Studie kombinieren wir biochemische, biophysische, strukturelle und zellbiologische Techniken um die Lokalisation von ROCK und MRCK in der Zelle zu studieren und die Struktur sowie die Membran-bindenden Eigenschaften näher zu beleuchten. Wir präsentieren die Struktur der Membran-bindenden regulatorischen Domänen von MRCK, der C1, PH und CNH Domäne und erste Erkenntnisse bezüglich der Bindemodalitäten MRCKs. Speziell interessant ist dabei, daß wir die erste bekannte Struktur einer CNH Domäne überhaupt gelöst haben und auf dem Weg sind besser zu verstehen, wie MRCK verschiedene Lipid- und Proteinsignale integriert. Mit Hilfe der Elektronenmikrokopie haben wir außerdem die niedrig aufgelöste Struktur des MRCK Volllängenproteins gelöst und können bestätigen, daß MRCK, genauso wie ROCK, in einer offenen, ausgestreckten Form vorliegt. Durch die Verwendung eines quantitativen und systematischen Hochdurchsatz-Assays (LIMA) konnten wir die Lipidliganden von ROCK und MRCK detaillierter bestimmen. Diese sehr nützliche Technologie ist außerdem mit Hilfe der Biooptischen Einrichtung an den Max Perutz Labs anderen Nutzern zugänglich gemacht worden. Die Kombination der Erkenntnisse über die dreidimensionale Anordnung der regulatorischen Domänen und die Lipidliganden wird zukünftig helfen zu verstehen, wie die spezifische Lokalisation dieser wichtigen Kinasen erzielt wird. Des Weiteren liefern wir wichtige Erkenntnisse bezüglich Akt1, einer weiteren lebenswichtigen Proteinkinase der AGC Familie. Im Journal PNAS beschreiben wir die die hochaufgelöste, nahezu vollständige Struktur Akts in seiner autoinhibierten Form, die wir mit Hilfe eines Lama Einzeldomänenantikörpers erzielen konnten. Wir definieren Charakteristiken der Regulation dieses wichtigen Enzyms und präsentieren Erkenntnisse bezüglich der Frage Wo, Wann und Wie Akt in der Zelle aktiv ist.