NMR-spektroskopische Untersuchung von funktioneller RNA-Dynamik

Konformationelle Übergänge in RNA Stem-Loop Strukturen bilden die Grundlage für funktionell bedeutsame Übergänge in großen RNA Molekülen. Dieses Projekt ist darauf ausgelegt, mittels kernmagnetischer Resonanz- Spektroskopie (Nuclear Magnetic Resoance, NMR) experimentellen Zugang zur Dynamik solch fundamentaler RNA-Faltungsmodule zu schaffen. Aufgrund der atomaren Auflösung NMR spektroskopischer Techniken ergibt sich die Möglichkeit, dynamische Prozesse aus verschiedenen Blickwinkeln zu betrachten (dynamische Eigenschaften sind in Makromolekülen nicht gleichverteilt). Ich habe vor, Methoden der Kernspinrelaxation aus den Bereichen der Proteinchemie und Biophysik auf das Gebiet der RNA übertragen, neue Experimente zu entwerfen und spektroskopische Methoden mit selektiver Isotopenmarkierung zu kombinieren. Mit diesem Ansatz werde ich detaillierte Einblicke in die Reaktivität und Dynamik verschiedener RNA Modellsysteme erhalten. Die Systeme decken ein breites Spektrum von Fragestellungen ab: zum Beispiel werden NMR-aktive Isotopen an strategischen Stellen in bistabilen RNA Molekülen plaziert, um (spontane) Umlagerungen systematisch zu charakterisieren. In einem zweiten Schwerpunkt wird die Nukleotidsequenz zweier miteinander reagierender RNA Moleküle verändert, um den Mechanismus der Reaktion zu studieren. Eine weitere interessante Fragestellung betrifft die Wirkung des bakteriellen RNA-bindenden Proteins CspA, das eine essentielle Rolle für die korrekte Faltung von RNA Molekülen unter Kälteschockbedinungen spielt, auf die kinetischen Parameter der vorgestellten Reaktionen. Die Resultate werden wichtige Einblicke in den Wirkmechanismus dieses Proteins gewähren. Je nach Fragestellung und System wird die Bewegung auf unterschiedliche Zeitskalen untersucht (Bewegung von Bindungsvektoren in Pikosekunden, Diffusion des Moleküls in Nanosekunden, konformationeller Austausch im Millisekundenbereich, langsame Übergänge zwischen stabilen Strukturen auf der Sekundenzeitskala, sowie chemische Reaktionen zwischen zehn Sekunden und Minuten). Zusätzlich befaßt sich das Projekt mit der Erarbeitung theoretischer Aspekte der erwähnten Methoden, um eine korrekte Aufnahme und Interpretation der Daten zu gewährleisten. Dieser Teil umfaßt die Berechnung von Relaxationsraten in Methylgruppen, die Analyse der Kinetik komplexer Reaktionsmechanismen, oder auch die Analyse von Relaxationsmessungen bei Interkonversion zwischen mehr als zwei Zuständen. Mit diesen Studien möchte ich einen wichtigen Beitrag zu einem umfassenden Verständnis funktioneller RNA Dynamik in Lösung leisten.

Die Funktion von Ribonukleinsäuren (RNAs) wurde nach der Formulierung des zentralen Dogmas der Molekularbiologie 1958 lange Zeit als die eines reinen Übermittlers sequentieller genetischer Information von DNA an die Exekutive der Zellen, die Proteine, gesehen. Dass die Rolle von RNA weitaus weiter gefasst werden muss, haben Forschungsergebnisse aus den letzten beiden Jahrzehnten ergeben. Die zeigten nämlich auf, dass nicht-kodierende (non-coding nc) RNAs für eine Reihe regulatorischer Funktionen auf den Ebenen der Replikation, Transkription und Translation essentiell sind, deren Bedeutung viel größer ist als noch vor einigen Jahren angenommen.Auf einer molekularen Ebene werden diese Funktionen durch die speziellen strukturellen und dynamischen Eigenschaften der RNA vermittelt soll, zum Beispiel, (als Antwort auf einen Umweltreiz) ein sogenannter Riboswitch das Ein- oder Ausschalten eines Transkriptionsprozesses vermitteln, signalisiert er das durch eine Änderung seiner Sekundärstruktur und begibt sich somit ins Terrain der favorisierten Targets der NMR-Spektroskopie. Solch strukturelle Flexibilität manifestiert sich auf der Energiehyperfläche solcher RNA Strukturen, die, wie eine Landkarte, stabile Faltungen als energetische Minima und den Aufwand für einen strukturellen Übergang als die Höhe der dazwischenliegenden Energiebarriere beschreibt. Letztere korreliert mit der Häufigkeit des Übergangs für die im Rahmen dieses Projekts untersuchten RNA Moleküle so zwischen ca. einem und einigen tausend pro Sekunde. Das Zeitfenster dieser Dynamik (als strukturelle Basis für eine instantane Reaktion auf einen Umweltreiz) kann durch verschiedene NMR-Methoden quantitativ beschrieben werden so werden Rückschlüsse auf funktionell relevante Aspekte der Energielandschaft gezogen.Sowohl strukturelle Aspekte als auch Übergangsraten wurden im Rahmen dieses Projektes an RNA Molekülen mit NMR-spektroskopischen Methoden vermessen - an speziell entwickelten Modellverbindungen (entwickelt am Institut für Organische Chemie in Innsbruck) und auch an biologisch relevanten RNA Molekülen. Dabei wurden nicht nur neue Experimente zur Charakterisierung von Struktur und Dynamik von Biomolekülen entwickelt, vielmehr ist es auch gelungen (in manchen Fällen auch bei Vorliegen relativ komplexer dynamischer Prozesse) funktionell relevante Freiheitsgrade der Energielandschaft zu rekonstruieren und Rückschlüsse auf den zugrundeliegenden Umlagerungsmechanismus zu ziehen.