Top-Down Massenspektrometrie von Proteinen und RNA

Die biomolekulare Forschung wäre heutzutage ohne die Beiträge der modernen Massenspektrometrie (MS) undenkbar. Für die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen und RNA mit MS haben sich im letzten Jahrzehnt zwei komplementäre Strategien entwickelt: der "top-down" und der "bottom-up" Ansatz. Im weiter verbreiteten "bottom-up" Ansatz werden die Biomoleküle von Interesse zunächst mit Enzymen in Lösung verdaut, und dann werden die Verdau-Produkte mit Massenspektrometrie analysiert. Im "top-down" Ansatz hingegen werden sowohl die intakten Biomolekül-Ionen als auch deren Fragmente aus Dissoziation im Massenspektrometer analysiert. Das Massenspektrum der intakten Ionen liefert unmittelbare Informationen über die Heterogenität der Biomolküle und mögliche Sequenzfehler, und charakteristische Unterschiede zwischen experimentellen und aus der DNA-Sequenz vorhergesagten Massenwerten lassen auf spezifische post-translationale oder -transkriptionale Modifikationen (PTMs) schliessen, z.B. 79.9663 Da für Phosphorylierung and 14.0156 Da für Methylierung. Diese Information über die Biomolekülmasse ist mit "bottom-up" Massenspektrometrie nicht zugänglich. Darüberhinaus kann mit einer "Fragment-Leiter" aus top-down MS Experimenten die Primärstruktur des Proteins vollständig bestimmt werden, einschliesslich aller Modifikationen. Trotz der wesentlichen Vorteile von "top-down" MS wird dieser Ansatz erst in jüngster Zeit zunehmend verfolgt. Dies ist zum Teil darin begründet, dass sich die Dissoziation von gasförmigen Biomolekül-Ionen im Massenspektrometer als relativ schwierig herausgestellt hat, insbesondere für grössere Ionen: Nach der Überführung in die Gasphase können die Biomolekül-Ionen kompakte Strukturen ausbilden, die dann im Dissoziationsschritt nicht fragmentieren. In diesem Projekt soll eine neue "top- down" MS Strategie realisiert werden, wobei die Biomolekül-Ionen durch das nachträgliche Aufbringen von elektrischer Ladung entfaltet, und durch Elektronen-Ionen Wechselwirkungen dissoziiert werden. Dieser neue Ansatz wird auf Biomoleküle in der Quellenregion des Massenspektrometers angewendet, wodurch ausgenutzt wird dass die Ionen im Übergang von der Lösung in die Gasphase vorübergehend entfaltete Strukturen annehmen. Weil die Fragmentierung und Konformation des Biomoleküls durch separate Prozesse bewirkt bzw. kontrolliert werden, kann thermische und Kollisions-Anregung zur Vermeidung des konformationellen Kollapses eingesetzt werden ohne die kritische Energie für die Abspaltung von PTMs zu überschreiten.