Immunologie unter dem Nanoskop

Gegenwärtig zielt wissenschaftliche Forschung in so gut wie allen Gebieten der Naturwissenschaften auf eine Erforschung des Nanokosmos - des Kollektivs von Strukturen mit Abmessungen zwischen 1 und 100nm - ab. Es existiert gegenwärtig ein großer Bedarf an Technologien, die den Zugang zu diesen Dimensionen ermöglichen, um im Nanokosmos strukturieren, manipulieren, oder mit hoher Auflösung messen zu können. In den Lebenswissenschaften weckt die Mannigfaltigkeit dieses Nanokosmos bei immer mehr WissenschafterInnen - aber auch bei Investoren mit langen Planungshorizonten - das Interesse am aufstrebenden Bereich der Nanobiotechnologie, also der Biotechnologie auf oder für die nanoskopische Dimension. Der erfolgreiche Projektantrag zielt darauf ab, Einzelmolekül-Mikroskopie als ein neues Werkzeug für das Studium von Nanostrukturen und molekularen Dynamiken in lebenden biologischen Zellen zu etablieren. Die Methode ist allgemein, auf eine Vielzahl von biologischen Systemen, anwendbar. Für das vorliegende Projekt fiel die Themenwahl auf einen brandaktuellen Bereich in der Immunologie, der Formierung der immunologischen Synapse zur T Zell Aktivierung. Die korrekte Formierung dieser stabilen Kontaktzone zwischen antigen-präsentierender Zelle und T Zelle stellt einen wichtigen Schritt in der Aktivierung unseres Immunsystems dar. Die Aktivierung von T Zellen hängt in kritischer Weise von der anhaltenden und aufeinander abgestimmten Interaktion von Liganden (i.e. die einen Partner einer molekularen Wechselwirkung) und Rezeptoren (i.e. die zweiten Partner dieser Wechselwirkung) auf den beiden gegenüberliegenden Zellen ab. Gegenwärtig müssen sich ForscherInnen allerdings auf kinetische Parameter verlassen, die in hochgradig artifiziellen Experimenten an aufgereinigten Substanzen (das sind Substanzen, die nicht im zellulären Milieu, sondern in hochreiner Form gelöst vorliegen) gewonnen wurden. In diesem Projekt werden neue Techniken der Einzelmolekül-Mikroskopie verwendet, um Interaktionen zwischen zwei verschiedenen Proteinen direkt im zellulären Kontext zu bestimmen. Darüber hinaus werden Substrukturen in der sich entwickelnden Synapse auf einer Größenskala von wenigen zehn Nanometern untersucht, wobei die hervorragende Positionsgenauigkeit der Methode ausgenutzt wird. Auf diesem Weg soll es gelingen, endlich die Rolle von Lipid-Domänen in der Aktivierung von T Zellen aufklären zu können. Bis jetzt gibt es viele Hinweise darauf, dass solche nanoskopischen Lipid-Plattformen für die korrekte T Zell-Aktivierung relevant sind. Wegen ihrer geringen Größe von wenigen Nanometern entzogen sie sich jedoch bislang einer direkten Beobachtung. Es ist faszinierend zu erkennen, dass bereits einige wenige Antigen-Moleküle die Ausbildung einer immunologischen Synapse bewirken können. Die extreme Empfindlichkeit der T Zell-Aktivierung lässt ultrasensitive Mikroskopie als die geeignete Methode erscheinen, um die dabei ablaufenden molekularen Re-Arrangements zu beobachten.

Hinter dem Titel meines Projektes Immunologie unter dem Nanoskop stand ein Wortspiel: Ich wollte klassische Mikroskopie welche aufgrund physikalischer Limitierungen nur für die Anwendungen auf einer Mikrometer-Skala oder darüber geeignet ist durch ein Verfahren ersetzen, welches durch die Beobachtung einzelner Moleküle auch in der Lage ist, auf der Nanometer-Skala Informationen zu gewinnen. Mittlerweile ist der englische Ausdruck Nanoscopy absolut üblich geworden, und die optische Abbildung auf einer Nanometer-Skala Stand der Forschung, zu der wir im Rahmen des Projektes auch maßgeblich beigetragen haben. In diesem Projekte ging es uns neben der Entwicklung der entsprechenden Mikroskopie-Methoden vor allem um deren Anwendung auf Fragen der Immunologie, speziell der antigen-spezifischen Aktivierung von CD4-positiven T-Zellen. Dazu bindet der T-Zell-Rezeptor das über MHCII präsentierte Antigen auf einer kontaktierten Antigen-präsentierenden Zelle (APZ). Uns gelang es gemeinsam mit unseren Partnern, diesen Zell-Zell Kontakt durch ein künstliches System nachzubauen, wobei die APZ durch eine künstliche Lipidmembran ersetzt wurde, welche mit den notwendigen aktivierenden Proteinen insbesondere antigen-beladenem MHCII ausgestattet wurde. Farbstoffmoleküle an den Proteinen ermöglichten es uns, gezielt den T-Zell-Rezeptor bei der Erkennung des Antigens zu beobachten. Dabei stellten wir fest, dass die Interaktionszeit drastisch verkürzt ist gegenüber bisherigen Annahmen; es zeigte sich, dass die Zelle an der Bindung zieht und somit die Zeitdauer des gebundenen Zustands verkürzt.Neben diesem zentralen Resultat des Projektes konnten noch zahlreiche weitere Erkenntnisse gewonnen werden. Vor allem beschäftigten wir uns mit der Untersuchung von Zellmembranstrukturen auf der Nanometerskala. Es gab Hinweise, dass sich Proteine und Lipide nicht frei in der Membran bewegen können, weil sie vom darunterliegenden Membranskelett behindert werden. Diese biophysikalisch höchst interessante Frage konnten wir durch eine spezielle Form der Mikroskopie mit extrem hoher Auflösung sowohl in der Zeit als auch im Ort klären: Beobachtungen einzelner lipidverankerter Proteine wiesen klar darauf hin, dass nur eine unwesentliche Beeinflussung von deren Beweglichkeit vorhanden sein kann. Spätere Messungen anderer Arbeitsgruppen bestätigten unsere Resultate.Darüber hinaus waren wir interessiert, ob lipid-mediierte Interaktionen von Proteinen in der Zellmembran existieren. Solche Effekte wurden im Rahmen der sogenannten Raft-Theorie aufgrund biochemischer Daten postuliert, jedoch konnten diese Strukturen nie beobachtet werden. Es wurde vermutet, dass sie entweder zu klein seien, zu kurzlebig, oder nicht vorhanden. Wir entwickelten eine Mikroskopiemethode basierend auf Einzelmolekülbeobachtungen, die speziell zur Lösung solcher Fragestellungen geeignet ist. Damit konnten wir nachweisen, dass Lipid-Plattformen in der Zellmembran existieren, welche allerdings sehr klein sind (<~20nm). Die Methode wurde in weiterer Folge für die Quantifizierung von lokalen Stöchiometrien in Proteinkomplexen verwendet.Zusammengefasst hat es das Start-Projekt ermöglicht, eine Vielzahl an maßgeschneiderten Einzelmolekül- Methoden zu entwickeln und auf das Studium von zentralen Membranprozessen anzuwenden.