Struktur, Faltung und Dissoziation gasförmiger Biomoleküle

Eine Vielzahl von nichtkovalenten Wechselwirkungen ist für die dreidimensionale Struktur und die Faltung eines biologisch aktiven Moleküls verantwortlich, darunter auch die Wechselwirkungen mit Lösungsmittel. In Experimenten in Lösung ist es allerdings schwierig oder sogar unmöglich, den Beitrag des Lösungsmittels von der intrinsischen Stabilität des Biomoleküls zu trennen. Ein neuer Ansatz um den Effekt externer Solvatation zu verstehen ist das Lösungsmittel komplett zu entfernen und die Struktur des Biomoleküls allein zu betrachten. In welchem Ausmass und auf welcher Zeitskala eine native Biomolekülstruktur in der Gasphase erhalten bleibt, und welche intramolekularen Wechselwirkungen für die (vorübergehende) Strukturstabilisierung in Abwesenheit von Lösungsmittel verantwortlich sind wird hier in "native electron capture dissociation" (NECD) Experimenten studiert werden. Es wird allerdings angenommen, dass die Biomolekülionen in der Gasphase strukturelle Veränderungen erfahren, die schliesslich zu stabilen Gasphasenstrukturen führen. Detaillierte Studien mit "electron capture dissociation" (ECD) und "electron detachment dissociation" (EDD) Experimenten werden dazu Strukturdaten und thermodynamische Parameter (Enthalpie, Entropie, freie Energie) von Faltungs-/Entfaltungs- Gleichgewichten liefern, um ein besseres Verständnis der dominanten Kräfte für die Faltung in der Gasphase zu erlangen. Darüberhinaus wird die Anwendbarkeit der kürzlich entwickelten EDD-Technik für die Untersuchung von Nukleinsäurestrukturen erforscht werden. In einem anderen Teil dieses Projektes wird ein neuer Ansatz zur nachträglichen Erhöhung der Ladung von biomolekularen Ionen aus Elektrospray-Ionisation (ESI) untersucht. Die zusätzliche Ladung wird die massenspektrometrische Analyse der biomolekularen Ionen aus mehreren Gründen wesentlich verbessern. Erstens erhöht die zusätzliche Ladung die Coulomb-Abstossung, was das Aufbrechen der Tertiärstruktur begünstigt, die sonst die Dissoziation der Biomolekülionen in Tandem-Massenspektrometrie Experimenten verhindern könnte. Zweitens könnte eine schmalere Ladungsverteilung der Molekülionen erreicht werden, wodurch auch die Ladungs- Heterogenität der Fragmentionen verringert und deren Detektion erleichtert wird (weniger Signale mit höherem Signal-Rausch Verhältnis). Drittens erhöht eine höhere Ladung das Signal-Rausch Verhältnis in Massenspektrometern mit Ladungs-empfindlicher Detektion. Viertens ist die Produktion von höher geladenen Ionen vorteilhaft für Sequenzierung mit ECD, da die Wahrscheinlichtkeit für Elektroneneinfang mit dem Quadrat der Ionenladung steigt. Fünftens vermeidet das Ladungs-induzierte Entfalten durch nachträgliches Aufbringen von Ladung im Gegensatz zum Aufheizen der Ionen den Verlust von post-translationalen oder -transkriptionalen Modifikationen.

In diesem Projekt wurden moderne Fragmentierungstechniken eingesetzt, um grundlegende Fragen zur Struktur und Faltung von Biomolekülen zu beantworten und neue Methoden zur Sequenzierung von Biomolekülen zu entwickeln. In einem Teil des Projekts wurde der Effekt der Desolvatisierung auf die Struktur von gasförmigen Proteinen studiert und es wurde festgestellt, dass die Gesamtstabilität einer Proteinstruktur in Lösung nicht mit der in der Gasphase korreliert ist. So ist zum Beispiel das Protein Cytochrome c in Lösung ausserordentlich stabil, aber nach dem Transfer in die Gasphase entfaltet es auf einer Zeitskala von Millisekunden, wohingegen die native Struktur des mässig stabilen Proteins KIX in der Gasphase auf einer Sekunden-Zeitskala erhalten bleibt und durch Erhitzen auf Temperaturen, die sogar das Auseinanderbrechen von kovalenten Bindungen bewirken, nur teilweise auffaltet. In einem anderen Teil des Projekts haben wir den Prozess studiert, in dem Proteine überhaupt erst in ihre biologisch aktiven Strukturen falten und fanden, dass das Lösungsmittel Wasser nicht nur schnelles sondern auch korrektes Falten erst möglich macht. Diese neuen Erkenntnisse sind von grosser Bedeutung für unser Verständnis dafür, wie verschiedene chemische Umgebungen wie zum Beispiel das Cytosol oder Membranen die Struktur und Stabilität von Proteinen verändern können. Ribonucleinsäuren (RNA) sind eine weitere Klasse von Biomolekülen, die unerlässlich für das Leben sind und deren vielfältige Funktionen über die Translation von DNA (Desoxyribonukleinsäure) in Proteine hinaus gerade erst genauer untersucht werden. Diese sogenannten nicht-kodierenden RNAs tragen oft posttranskriptionale Modifikationen, die bestimmend für ihre spezifische Funktion sind, aber eine RNA Sequenzierung mit neuesten Methoden nahezu unmöglich machen. Aus diesem Grund haben wir in diesem Projekt einen neuen, auf Massenspektrometrie basierenden, Ansatz zur de novo Sequenzierung von hochmodifizierter RNA entwickelt, bei dem zwei verschiedene Fragmentierungstechniken zum Einsatz kommen, von denen eine über einen komplexen von uns vorgeschlagenen Radikal-Mechanismus abläuft. Darüberhinaus haben wir die RNA-Fragmentierung durch Erhitzen der Ionen untersucht, wobei wir fanden, dass es sich um einen schrittweisen Mechanismus handelt, der Ähnlichkeiten zur Esterumlagerung und Spaltung bei der RNA-Hydrolyse in Lösung aufweist. Unser auf Basis dieser Fragmentierungstechniken neu entwickelte direkte Ansatz kann sowohl posttranskriptionale als auch synthetische Modifikationen identifizieren und lokalisieren, und kann auf RNA von bis zu ~80 Nukleotiden, darunter Transfer-RNA, angewendet werden.