Molekulare Charakterisierung des Lebenszyklus von mikroRNAs

Kleine RNAs regulieren die Expression von Genen in allen Eukaryonten und haben enormes biotechnologisches und therapeutisches Potenzial. MikroRNAs gehören zur größten Familie von trans-regulatorischen Molekülen. In Fliegen und Säugetieren regulieren sie mehr als die Hälfte aller Protein-kodierenden Gene. Auf der molekularen Ebene dienen mikroRNAs der Zielorientierung von Nukleoproteinkomplexen, sogenannten Stilllegungskomplexen. Dabei interagieren sie mit komplementäre Sequenzen von Boten-RNAs, um diese zu regulieren. In Tieren haben mikroRNAs meist nur geringe Komplementarität zu Boten-RNAs. Diese geringe Spezifität ermöglicht jeder mikroRNA bis zu hunderte von Transkripten zu binden. Gleichzeitig sorgt dies dafür, dass die mikroRNAs stabil mit dem Stilllegungskomplex assoziiert bleiben. Binden mikroRNAs jedoch an Boten- RNAs mit hoher Komplementarität so werden sie zerstört. Trotz intensiver Forschung ist bislang nur unzulänglich geklärt wie mikroRNAs selbst unter Kontrolle gehalten werden. Ich schlage vor die Komplementaritäts-abhängige Zerstörung von mikroRNAs als Model zu verwenden um dies zu verstehen. Hierzu werden wir biochemische, genetische und bioinformatische Methoden im Modellorganismus Drosophila melanogaster verwenden. Die daraus hervorgehenden Hypothesen werden dann in humanen Zellkulturen, deren Extrakten und in der lebenden Maus getestet. In diesem Antrag werden wir die mikroRNA-degradierende Enzyme identifizieren, die der mikroRNA-Zerstörung zugrundeliegenden molekularen Mechanismen charakterisieren, sowie dem entgegenwirkende Prozesse identifizieren. Unsere Ergebnisse werden direct zur Entwicklung von therapeutischen Strategien verwendet. Ausserdem werden wir eine neue Methode entwickeln, welche es uns erlauben wird die das dynamische Zusammenspiel zwischen mikroRNA-Zerstörung und Produktion zu analysieren. Zusammenfassend sind unsere Experimente daraufhin ausgerichtet, den Lebenszyklus von mikroRNAs auf molekularer Ebene zu analysieren.

Kleine nicht-kodierende RNAs regulieren die Genexpression in fast allen Eukaryonten und haben ein enormes biotechnologisches und therapeutisches Potenzial. MikroRNAs gehören zur größten Familie der trans-aktivierenden genregulatorischen Moleküle in mehrzelligen Organismen. In Fliegen und Säugetieren kontrollieren sie mehr als die Hälfte des proteincodierenden Transkriptoms und fungieren als Schlüsselregulatoren der Entwicklung, Physiologie und Krankheit von Organismen. Dieses Projekt konzentrierte sich auf den am wenigsten verstandenen Aspekt der durch kleine RNAs vermittelten Genregulation - die Regulation der mikroRNA-Homöostase. Unser Ziel war es zu verstehen, wie unterschiedliche kleine RNA-Profile erstellt und erhalten werden, um die Expression von mehr als der Hälfte aller proteincodierenden Gene in Fliegen und Säugetieren zu koordinieren. Zu diesem Zweck erstellten wir einen umfassenden Atlas der post-transkriptionellen Modifikationen in kleinen RNAs und ihren Vorläufern, der zeigt, dass miRNAs und ihre Vorläufer häufig an ihrem 3'-Ende durch Uridylierung und Adenylierung modifiziert werden; und wir bestimmten die Herkunft und die biologische Funktion dieser Modifikationen, die eine entscheidende Rolle bei der Regulation der mikroRNA-Reifung spielen. Weitere Studien zeigten, dass die RNA-Uridylierung auch eine entscheidende Rolle bei der Regulation kodierender und nicht-kodierender RNAs spielt und somit eine neue Schicht in der Regulation der Genexpression etabliert. Wir haben auch eine neue Methode, namens SLAMseq, entwickelt, die es ermöglicht, das Schicksal von RNA-Molekülen im Inneren lebender Zellen zu verfolgen. Durch die Kombination von SLAMseq mit einer massiven parallelen Sequenzierung von mikroRNAs haben wir die intrazelluläre Kinetik der miRNA-Biogenese, ihre Ladung in Ribonukleoprotein-Komplexen und ihren Zerfall bestimmt. Unsere Untersuchungen ergaben, dass mikroRNAs innerhalb von Minuten produziert werden, was eine enge intrazelluläre Kopplung der Biogenese zeigt, die durch die Prä-mikroRNA-Uridylierung selektiv gestört wird. Die Kontrolle über die Argonaute-Protein-Homöostase erzeugt einen kinetischen Engpass, der mit der nicht-kodierenden RNA-Überwachung kooperiert, um eine getreue mikroRNA-Beladung zu gewährleisten. Schließlich ermöglicht der regulierte Zerfall kleiner RNAs den selektiven, schnellen Umsatz von mikroRNAs, nicht aber von small interfering RNAs (siRNAs), was wesentliche Unterschiede in der Robustheit kleiner RNA-induzierter Gen-Stilllegungs-Pfade widerspiegelt. Die zeitaufgelöste Sequenzierung kleiner RNAs eröffnet neue experimentelle Wege, um die Zeitskala, die molekularen Eigenschaften und die Regulation der kleinen RNA-induzierten Gen-Stilllegungs-Wege in lebenden Zellen zu entschlüsseln. Alles in Allem lieferten unsere Studien den ersten umfassenden Einblick in die intrazelluläre Kinetik von zellulären kleinen RNA-abhängigen Gen-Stilllgungs-Wegen. Über die vorgeschlagenen Arbeiten hinaus haben wir SLAMseq auch zur Untersuchung genregulatorischer Wege bei Krebs eingesetzt, um die Funktion des wichtigsten onkogenen Transkriptionsfaktors Myc zu entschlüsseln. Das Projekt führte zu einer Patentanmeldung. Die zugrundeliegende Technologie wurde von der Lexogen GmbH als "SLAMseq metabolic RNA sequencing kit" für den weltweiten Vertrieb lizenziert und vermarktet.