smFRET Studien Translations-kontrollierender Riboschalter

Ziel des Projekts ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen eines bestimmten Typs der Genregulation, nämlich jener, die durch zelluläre Metaboliten und ihre hochselektive Bindung an bestimmte Abschnitte der mRNA eine An- oder Abschaltung von Genen, welche typischerweise in der Biosynthese der Metaboliten selbst involviert sind, bewirken. Derartige Regulationselemente auf RNA-Ebene werden als Riboschalter bezeichnet und treten vor allem in Bakterien auf. Bisherige strukturelle Studien konnten zeigen, dass Riboschalter in Abhängigkeit der Konzentration des Liganden - vereinfacht dargestellt - zwei unterschiedliche Strukturen ausbilden können und dadurch Sequenzabschnitte, die für die Erkennung der Genexpressionsmachinerie notwendig sind, entweder freilegen oder maskieren. Allerdings sind die chemisch-physikalischen Zusammenhänge zwischen Metabolit- induzierter Riboschalterfaltung und der Fähigkeit zur Interaktion von mRNA und dem Expressionsapparat weitgehend unerforscht. Um dieses Wissensdefizit zu reduzieren werden wir eine Kombination hochmoderner chemischer, biochemischer und biophysikalischer Methoden, einschliesslich der Einzelmolekülspektroskopie, zur Erkundung der Riboschalter-basierten Translationskontrolle anwenden. Unser Arbeitshypothese besagt, dass in der definierten zeitlichen Verknüpfung und Dynamik von konformationellen RNA-Strukturänderungen (auf Riboschalter Sekundär- und Tertiärstukturebene), Ligandbindungskinetik, und der eigentlichen mRNA-Erkennung durch die Translationsinitiationsfaktoren der Schlüssel für die Ausbildung und die Effizienz der Signaltransduktionskette liegt. Wir fokusieren uns dabei auf die Klasse der SAM-II- und Purin-Riboschalter, deren Schalterdomänen eindeutig identifiziert und deren ligand-gebundenen Strukuren gelöst wurden. Das vorliegende Projekt führt nun Schlüsseltechnologien der RNA-Synthesechemie und neuartige Markierungsstrategien (welche im Labor von R. Micura entwickelt wurden) mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(FRET)- Einzelmolekülabbildungsverfahren (welche im Labor von S. C. Blanchard entwickelt wurden) zusammen. Diese einzigartige Kombination wird es erlauben, erstmalig Daten zur inherenten Dynamik derartig komplexer Systeme zu erhalten, die für ihre Interpretation wiederum in die jeweilige Kernkompetenz der beiden Gruppenleiter fallen, nämlich Riboschalter und RNA-Faltung (R. Micura), und Translationskontrolle und Ribosomen (S. C. Blanchard). Die zu erwartenden Ergebnisse sollen grundlegende Einblicke in die Rolle der Dynamik von Riboschalter- kontrollierter Regulation der ribosomalen Proteinsynthese liefern und unser Verständnis zu dieser neuen Art der Genexpressionskontrolle entscheidend vertiefen.

Das Ziel des Projekts war die biophysikalische Aufklärung der molekularen Mechanismen von RNARiboschaltern im Kontext der ribosomalen Translation. Wie dabei die unterschiedlichen Faltungswege der wachsenden naszenten mRNA beschritten werden, die für die Ja/Nein Antwort des entsprechenden Gens verantwortlich sind, ist trotz intensiver Beforschung in den letzten Jahren weitgehend ungeklärt geblieben. Zu Beginn des Projekt war nur sehr wenig bekannt über die intrinsische Faltungsdynamik von Riboschalter-Domänen, sowie des dynamischen Verhaltens ihrer Aptamer/Ligand-Bindung; beide Prozesse werden als entscheidende Determinanten für die Riboschalterfunktion gewertet. Die offensichtliche Bedeutung von Riboschaltern für die Genregulation und ihr Potential im Hinblick auf neuartige Wirkstoff-Zielmoleküle haben uns in diesem Projekt dazu veranlasst, chemische Synthesen für ihre Derivatisierung zu entwickeln, um das dynamische Verhalten mittels modernen Spektroskopie (Einzel-Molekül Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer; smFRET) in Kollaboration mit Scott C. Blanchard (Weill Cornell Medicine) zu erforschen. Um dieses Ziel zu erreichen, mussten mehrere Hürden überwunden werden. Erstens, wir entwickelten neue Methoden zur Synthese mehrfach markierter RNA. Zweitens, basierend auf den markierten RNA-Derivaten konnte mittels smFRET-Spektroskopie der Einfluss von miteinander interagierenden Struktureinheiten, welche von der eigentlichen Ligandbindungstasche entfernt sind, auf die Faltungs- und Bindungsdynamik aufgeklärt werden (TPP Riboschalter). Drittens, diese Untersuchungen wurden dahingehend erweitert, den Einfluss individueller Sekundärstrukturelemente (deren Anwesenheit/Abwesenheit) zu bestimmen (preQ1 Riboschalter). Viertens, unsere Untersuchungen wurden mit Ensemble-Fluoreszenz- und NMR-spektroskopischen Experimenten ergänzt, um Nukleosidkonformationsänderungen als auch Faltungsgleichgewichte kinetisch und thermodynamisch zu erfassen (preQ1 Riboschalter). Die erzielten Resultate zeigen den Einfluss der Struktur auf das dynamische Verhalten von Ligandbindung und Faltungswegen auf und liefern ein tiefes Verständnis zur Funktionsweise von Riboschaltern. Dies wird das Design von Sensor- und Schaltermodulen für biotechnologische Aplikationen erleichtern. Unsere Untersuchungen zur Riboschalter-gesteuerter Translationsinitiation erwiesen sich technisch komplex und rechtfertigen weiter Folgestudien. Darüberhinaus wurden die Nähe von Riboschaltermotiven zu neu entdeckten Ribozymenklassen (Ronald Breaker, Yale) erkannt und Untersuchungen in Angriff genommen, die molekularen Zusammenhänge zwischen Riboschalter- und Ribozym-Faltung/Funktion zu entschlüsseln. Erste Ergebnisse zur Struktur der neuen Ribozyme wurden durchgeführt und konnten bereits publiziert werden.