Struktur und Regulation des myofibrillären Z-Scheibe Interaktoms

Voll entwickelte Z-Scheiben bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Proteine, und man kann sie als eine der komplexesten makromolekularen Strukturen in der Biologie betrachten. Dieses komplizierte Geflecht von Wechselwirkungen muss ständig fein abgestimmt und aufrecht erhalten werden. Jüngste Studien haben eine grundlegende Funktion von Signalwegen und der Chaperon-assistierten selektiven Autophagie (CASA) für die Regulation der Dynamik und des Turnovers der Komponenten der Z-Scheibe nahe gelegt. In der zweiten Phase des Projekts wollen wir zwei Hauptfragen beantworten: (1) Wie moduliert die Phosphorylierung bestimmte Protein- Protein-Wechselwirkungen von Z-Scheiben-Komplexen, insbesondere diejenigen von Filamin C mit seinem Interaktionspartnern? (2) Wie vermittelt Myopodin/SYNPO2 Interaktionen mit dem Autophagosomen-bildenden Sub-Komplex des CASA Maschinerie? Beide Projekte werden durchgeführt unter Verwendung integrativer Strukturbiologie-Ansätze, in denen hochauflösende Strukturuntersuchungen ergänzt werden von Ansätzen niedrigerer Auflösung, um gemeinsam wertvolle strukturelle Informationen zu generieren. Diese Strukturanalysen werden in der Folge die Grundlage für das Design von Experimenten sein, die funktionelle Fragen mit einer Mischung aus biochemischen und zellulären Assays adressieren.

Im Verlauf der zweiten Förderperiode konzentrierten sich die Forschungsaktivitäten auf das Verständnis der Auswirkungen posttranslationaler Modifikationen in den Filamin C-Domänen 19-21, auf die Wechselwirkung mit ausgewählten Bindungspartnern (FATZ-1 und Pgm5 / Aciculin) sowie auf die Strukturanalyse von Komplexen aus FATZ-1 mit Filamin C und -Actinin-2 sowie zur strukturellen und biochemischen Analyse von PGM5 / Aciculin. Eine vergleichende biophysikalische Analyse von FlnC d19-21 und seinen phosphomimetischen Varianten (S2233D, S2236D) zeigte im Vergleich zum Wildtyp-Konstrukt eine deutlich erhöhte Rückfaltungskapazität des modifizierten Proteins nach thermischer Entfaltung. Da die thermische Entfaltung ein Ersatz für die mechanische Belastung und Entfaltung ist, wird angenommen, dass dies auf die erhöhte Fähigkeit des Proteins zurückzuführen ist, sich von mechanischen Belastungen und mechanischen Schäden während der Muskelkontraktion zu erholen. Die Analyse der Bindungsaffinitäten von FlnC d19-21 und seiner phosphomimetischen Mutanten zu FATZ-1-Varianten zeigte, dass die Phosphorylierung tatsächlich die Affinität von FlnC zu FATZ-1 regulierte, daher die beiden Wechselwirkungsstellen mit der N-terminalen-Region von FATZ- aufhob. Andererseits hat eine einzige phosphomimetische Mutation in FlnC d19-21 keinen Einfluss auf die Wechselwirkung mit PGM5 / Aciculin. Weiterhin fanden wir heraus, dass FlnC und -Actinin-2 um die Binding-Site auf FATZ-1 konkurrieren, die sich im C-terminalen Teil des Proteins befindet, wo -Actinin-2 FlnC verdrängt, was zur Bildung eines ternären Komplexes zwischen FlnC, -Actinin-2 und FATZ-1 führt. Die Kristallstrukturbestimmung von FlnC d21 und des -Actinin-2-Stabes im Komplex mit FATZ-1 ermöglichte erstmals die Visualisierung der Wechselwirkungen auf atomistischer Ebene. Tatsächlich sind dies die ersten Kristallstrukturen des intrinsisch gestörten Z-Disk-Proteins FAZT-1 mit zwei seiner Hauptbindungspartner FlnC und -Actinin-2. PGM5 / Aciculin war ursprünglich nicht Teil der Forschungspläne, aber da PI1 entdeckte, dass PGM5 / Aciculin mehrere Z-Scheiben-Proteine bindet, sollte seine strukturelle und biochemische Charakterisierung in Angriff genommen werden. Im Verlauf der Bindungsstudien stellten wir fest, dass PGM5 / Aciculin FATZ-1 bindet, was zuvor nicht gezeigt wurde. Zusätzlich haben wir zeigen können, dass PGM5 / Aciculin eine enzymatische Aktivität der Phosphoglucomutase besitzt, die das Paradigma bezüglich der PGM5 / Aciculin-Rolle in den Z-Scheiben verändert und ein rein strukturelles Protein für ein Gerüstenzym bildet, welches möglicherweise von Interaktionspartnern reguliert wird. Wir bestimmen damit seine Kristallstruktur, die unerwartet bemerkenswerte Unterschiede in der Konformation des aktiven Zentrums enthüllte. Diese Ergebnisse sind eine solide Grundlage für eine Reihe von Folgeexperimenten sowohl auf struktureller als auch auf biochemischer Ebene, um den Wirkungsmechanismus und seine potenzielle Regulation durch Z-Scheiben-Bindungspartner zu verstehen.