Mikro-RNA in der renalen Fibrose

Renale Fibrose stellt die gemeinsame Endstrecke aller glomerulären und tubulo-interstitiellen Erkrankungen dar. Fokal-segmentale Glomerulosklerose (FSGS) ist eine relativ häufige humane glomeruläre Nierenerkrankung, deren klinische Häufigkeit zunimmt und die gegenwärtig die häufigste Ursache für Proteinurie ist. Ein diagnostisches Charakteristikum dieser Erkrankung ist eine progressive glomeruläre Fibrose/Sklerose, die eine völlige Vernarbung der Glomeruli verursacht. Wir haben ein reproduzierbares Mausmodell der FSGS durch Überexpression der miR- 193a 1 durch Doxycyclin-Induktion entwickelt. Die glomeruläre Überexpression der miR-193a spielt auch in der humanen FSGS eine Rolle. In diesem Antrag wollen wir das zugrunde liegende Genexpressionsprogramm und die Genregulation herausfinden, welche die fibrotischen/sklerotischen glomerulären Schädigungen im Mausmodell und in der humanen FSGS verursachen. FSGS wird in 2 Monate alten, erwachsenen Mäusen induziert, die Glomeruli werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Erkrankung isoliert, die mRNA wird extrahiert und deep RNA sequencing (RNASeq) unterworfen. Von jedem Zeitpunkt wird das Genexpressionsprofil der normalen Kontroll- Glomeruli von jenem der erkrankten Glomeruli subtrahiert und bioinformatisch aufgearbeitet. Danach erfolgt eine proteomische Analyse von Laser Capture mikrodissezierten Glomeruli von Cryostat-Schnitten nativer Mausnieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Erkrankung und auch aus normalen Nieren, aus denen die Zellen vorsichtig durch ein etabliertes Extraktionsprotokoll mit Detergenzien herausgelöst werden. Die mikrodissezierten zellfreien Matrix-"Geister" der Glomeruli werden tryptisch verdaut und die Peptide massenspektroskopisch analysiert. Wir erwarten von dieser kombinierten Vorgangsweise einen Masterplan der molekularen Mechanismen, welche die Initiation und die Progression glomerulärer Fibrose verursachen. Dies umfasst die Identifikation der relevanten glomerulären mRNAs, der korrespondierenden Proteine in den fibrotischen Arealen und der Chemokine und Wachstumsfaktoren, die an der Matrix kleben. Da miR-193a-Überexpression auch in einem großen Prozentsatz der humanen FSGS-Patienten beobachtet wurde, werden wir die dargestellte Analyse auch an menschlichen Biopsien wiederholen. Die Genexpressionsanalyse der Glomeruli der sich entwickelnden FSGS in der Maus in Kombination mit den Ergebnissen der isolierten humanen Glomeruli von FSGS-Patienten sollte ein einzigartiges Datenset ergeben, das es ermöglicht, die Entwicklung der FSGS in einem molekularen Detail zu verfolgen, das bisher nicht möglich war. Die sich daraus ergebenden geplanten Therapieexperimente sind die ersten gezielten Interventionen, um FSGS zu verhindern. Wir werden Mäusen eine tiny locked nucleic acid (LNA) spezifisch für miR-193a (beide Stränge) in während der Entwicklung der Doxycyclin-induzierten FSGS verabreichen. Die Inhibition der FSGS wird durch die Reduktion der Proteinurie und der Abflachung der Podozyten dokumentiert, und die Genexpressionsprofile isolierter Glomeruli werden mittels RNASeq analysiert. Vorläufige Experimente mit einer tiny LNA waren ermutigend. Schließlich werden wir die molekularen Mechanismen, die in der glomerulären und tubulo-interstitiellen Fibrose aktiv sind, vergleichen. Letztere werden von unseren Forschungspartnern bereitgestellt. In beiden Fällen legen wir besonderen Wert auf die gemeinsamen Signalwege, die von den miRNAs kontrolliert werden, die in beiden Systemen operativ sind. Das Hauptziel dieses konzertierten Projektes ist es, eine mögliche gemeinsame "Achillesferse" in beiden Formen der Fibrose zu finden und diese Stelle für die erste realistische Möglichkeit einer gemeinsamen gezielten Therapie auszunützen. 1 Gebeshuber CA et al. Focal segmental glomerulosclerosis is induced by microRNA-193a and its downregulation of WT1. Nat Med. 19, 48187, 2013.

Entzündliche Veränderungen der Niere sind die Ursache einer Fibrose und des Verlustes der Nierenfunktion. Dieses Projekt beruht auf unserer früheren Entdeckung eines Maus Modells einer segmental-fokalen Sklerose, in welchem der Beginn der Erkrankung durch Aktivierung einer transgenen mikro-RNA genau bestimmt werden kann. Wir haben die biochemischen Veränderungen während der initialen Stadien der Fibrose mittels Massenspektroskopie analysiert. Das Ergebnis ist eine unerwartete neue Rolle des Gerinnungssystems als Auslöser der Fibrose. Dies ist von potentieller Wichtigkeit, da eine anti-koagulative Therapie in früheren Krankheitsstadien den Fibroseprozess verhindern oder zumindest verzögern könnte. Aus diesem Projekt hat sich ein weiteres entwickelt, das aus einer Zufallsbeobachtung stammt. Uns ist aufgefallen, dass die Lymphgefäße in entzündlich veränderten und beginnend fibrotischen Nieren von einer dicken Schichte von Exosomen umgeben sind. Exosomen sind intrazelluläre Vesikel, die von Endothelzellen in das Bindegewebe freigesetzt werden. Wir haben entdeckt, dass diese Vesikel Proteine enthalten, welche Entzündungszellen anlocken und die Entzündungsreaktion verstärken. Wir konnten zeigen, dass auch Karzinomzellen den gleichen Mechanismus benützen, um Metastasen in den Lymphknoten zu setzen. Diese neuen Befunde sind ein Meilenstein im Verständnis der Biologie der Entzündung im Allgemeinen und liefern Hinweise für eine gezielte Therapie inflammatorischer Krankheiten und ihrer Konsequenzen, wie Vernarbung und Fibrose.