Effiziente Freie-Energie- und Samplingmethoden für Protein-Protein-Wechselwirkungen

Den komplexen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und deren Netzwerken kommt in den modernen molekularen Lebenswissenschaften große Bedeutung zu. In den pharmazeutischen Wissenschaften verlegt sich der Fokus von `small-molecule drugs` zu sogenannten `biologicals`, darunter auch komplexe Proteinsysteme. Die rechnergestützte Beschreibung solcher Wechselwirkungen fördert ein besseres Verständnis auf molekularer Ebene und die Vorhersage von Affinitäten zwischen Proteinen bereitet den Weg für ein rationelles Design neuer Therapeutika. Die korrekte Beschreibung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und relevanten Unterschieden in der freien Energie hängt maßgeblich vom ausreichenden Sampling aller relevanten Konformationszustände, sowohl im gebundenen als auch im ungebundenen Zustand der Bindungspartner, ab. Während es heute für die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und kleinen Molekülen relativ effiziente rechnergestützte Werkzeuge gibt, ergeben sich bei Protein-Protein Wechselwirkungen neue Schwierigkeiten durch die große Diversität von Aminosäuresequenzen und die inhärente Flexibilität von Proteinstrukturen. Eine weitere Herausforderung bilden Proteine mit intrinsisch ungeordneten Regionen. Den vorliegenden Antrag unterbreitet ein internationales, interdisziplinäres Forscherteam mit dem Ziel der Entwicklung effizienter Freie-Energie- und Enhanced-Sampling-Methoden zur Berechnung von freien Bindungsenergien von komplexen Proteinsystemen. Als Modellsystem soll die 14-3-3 Proteinfamilie und deren Wechselwirkungen mit Tyrosinhydroxylase dienen. Im ungebundenen Zustand sind die relevanten Teile der Tyrosinhydroxylase intrinsisch ungeordnet und die Affinität für viele unterschiedliche Sequenzen muss bestimmt werden. NMR Experimente werden durch Hamiltonian und Temperature Replica Exchange Molecular Dynamics-Simulationen unterstützt um das konformationelle Ensemble des Partnerproteins zu beschreiben. Zugleich wird die Third- Power Fitting / One-Step Perturbation-Methode ausgebaut um ein universelles Modell zur Berechnung freier Energie-Differenzen zwischen Aminosäuren zu entwickeln, das die effiziente Vorhersage von Bindungsenergien erlaubt. Der Bindungsvorgang selbst wird durch Hamiltonian Replica Exchange Simulationen in Verbindung mit distancefield distance restraints beschrieben werden. Im Ganzen werden die entwickelten Methoden für eine große Spannbreite an Protein-Protein- Wechselwirkungen anwendbar sein und die enhanced sampling-Werkzeuge werden die Berechnung von komplexen Potential of Mean Force Profilen zur Beschreibung der Interaktionen zwischen sehr flexiblen Molekülen möglich machen.

Das Projekt hatte die Entwicklung mehrerer computergestützter und experimenteller Methoden zur Beschreibung von Protein-Protein-Wechselwirkungen als Ziel. Das österreichische Teilprojekt konzentrierte sich dabei auf die Entwicklung von computergestützten Methoden, während sich das tschechische Teilprojekt hauptsächlich auf die experimentelle Seite konzentrierte. Die Berechnungsmethodik wurde entwickelt und auf eine Reihe relevanter Modellproteine angewendet, wie (1) das Oligopeptide-bindende Protein A, (2) einen Komplex von Ubiquitin mit einer Ubiquitin-Bindungsdomäne der humanen DNA-Polymerase und (3) eine Reihe kleiner Peptide. In der Zusammenarbeit mit dem tschechischen Team wurden die Methoden zusätzlich auf 14-3-3-Proteine und ihre Komplexe mit ausgewählten phosphorylierten Bindungspartnern angewendet. Im österreichischen Teilprojekt haben wir hauptsächlich zwei Berechnungsansätze verwendet. Im ersten Ansatz untersuchten wir die Stärke der Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen, sowie einem Protein und einem Peptid direkt, indem wir die Arbeit, welche erforderlich ist, um die beiden Bindungspartner zu trennen, berechneten. Im Rahmen dessen wurden Molekulardynamiksimulationen eingesetzt, um den gesamten Bindungsweg zu beschreiben. Dabei ist entscheidend, dass dies vollständig und reversibel durchgeführt wird. Wir haben die Distancefield-Methode, die bereits zuvor in unserer Gruppe entwickelt wurde, angewendet und weiters einen neuen Ansatz etabliert, um eine vollständige Beschreibung des Bindungsprozesses zu gewährleisten. Die berechneten Bindungsaffinitäten zeigten eine bemerkenswerte Übereinstimmung mit den experimentell gemessenen Werten. Im zweiten Ansatz wurden die Auswirkungen von Mutationen auf Proteine und deren Bindungspartnern untersucht, indem die Änderung der freien Energie infolge einer Mutation einer spezifischen Aminosäure innerhalb des Proteins berechnet wurde. Dies erlaubte es uns, die Stabilität des 14-3-3-Proteins sowie die Dimerisierung einer vorgeschlagenen Mutante vorherzusagen. Darüber hinaus konnten wir mithilfe dieser Methode die relative Bindungsstärke einer Anzahl kleiner Peptide an das Oligopeptid-bindende Protein vorhersagen. In diesem Protein spielen Wassermoleküle eine besondere Rolle, um die Bindungen zu erleichtern. Deshalb haben wir eine Reihe an Methoden in ihrer Fähigkeit verglichen, mit Wassermolekülen während solcher Berechnungen umzugehen. Schließlich haben wir eine Methode zur effizienten Berechnung vieler Mutationen an einer einzigen Position innerhalb des Proteins entwickelt, wobei die Methoden One-Step Perturbation und Third-Power Fitting kombiniert wurden. Dabei wurden bemerkenswerte Übereinstimmungen mit wesentlich zeitaufwendigeren Simulationen erhalten, was nahelegt, dass diese Methode