EUROCORES EuroMEMBRANE_OXPL-Protein targets and apoptotic signalling of oxidized phospholipids

Our current studies in the framework of the SFB Lipotox aim at elucidating the toxicity mechanisms of oxidized phospholipids (oxPL) in macrophages. To understand the molecular basis of lipid-induced cell death, we investigate the uptake and stability of these lipids in cultured cells, and identify their primary targets on the proteome and transcriptome level. In addition, we analyze the intracellular signaling that is triggered by these compounds with emphasis on the apoptotic pathways associated with sphingolipid metabolism (Aim 3). For these experiments, established cell lines and primary cell preparations are used. The entire project is based on chemically well defined lipid oxidation products. Fluorescent analogs of oxPLs are being used as specific molecular tools for the identification of the primary molecular targets and the lipolytic activities responsible for oxPL degradation. In the framework of the EU project OXPHOS, we will characterize the interactions of the oxPLs with their target proteins in living cells and their physiological consequences as follows. 1. GFP-tagged proteins will be expressed in order to identify the intracellular localization of the protein targets that are identified by the functional proteomic studies in the SFB Lipotox (see the enclosed poster which was presented at the 2nd International Graz Symposium on Lipid and Membrane Biology: Focus on Lipotoxicity, March 13-15, 2008 Graz, Austria). 2. Fluorescence energy transfer experiments will be performed to determine the spatial proximity between the fluorescent lipid analogs and the GFP-tagged protein candidates. 3. Knock down experiments using siRNA should help identify the lipid-associated proteins that are essential for activation of acid sphingomyelinase, which is a key component of apoptotic signaling, and the cytotoxic effect of oxPL. In summary, the proposed project should lead to the identification of the primary signaling proteins that are involved in the toxicity of oxidized phospholipids in vascular cells.

Oxidativer Stress ist eine Entgleisung natürlicher, lebenserhaltender Prozesse im Körper. Dieses Phänomen kann einerseits als Folge von Erkrankungen oder Umweltbelastungen auftreten oder auch das Entstehen von Erkrankungen verursachen. Oxidative Veränderungen von Biomolekülen als Folge der Belastung durch sogenannte reaktive Sauerstoffspezies ist kausal an der Entstehung und dem Verlauf von Atherosklerose beteiligt. Diese chronische Erkrankung, die durch schlechten Lebensstil und ungesunde Ernährungsgewohnheiten gefördert wird, ist mit ihren Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall für die Mehrzahl der Todesfälle in der westlichen zivilisierten Welt verantwortlich. Atherosklerose ist eine Fettstoffwechselerkrankung und die oxidative Modifizierung der Fette und Eiweißststoffe im Blut, vor allem derer, die in den sogenannten Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) transportiert werden, spielen eine Schlüsselrolle in der Atherogenese. Sie führen dazu, dass das LDL und seine Komponenten nicht in den peripheren Zielzellen landen sondern in den Zellen der Arterienwand. Dieser Vorgang ist der Beginn einer verhängnisvollen biochemischen Kaskade, die schließlich zum Gefäßverschluss führt. Unser Projekt war der Toxizität oxidierter Phospholipide (OxPl) in vaskulären Zellen gewidmet. Diese bioaktiven Lipide werden bei der oxidativen Modifizierung hochungesättigter Phospholipide im LDL und in den Zellmembranen gebildet. Permanente Einwirkung von OxPl schädigt die Funktion der Enzyme, verändert den Fettstoffwechsel in den vaskulären Zellen und führt nebst anderen Effekten zum Zelltod. In unserem Projekt haben wir mit biochemischen Methoden die Funktion von Eiweißstoffen (Enzymen) identifiziert, die direkt von den OxPl angegriffen werden und haben in der Folge diese Wechselwirkungen erstmals direkt in der lebenden Zelle unter dem Mikroskop in Echtzeit sichtbar gemacht. Für diesen Zweck wurden die OxPl sowie die betroffenen Eiweißmoleküle mit Fluoreszenzsonden markiert und hierauf fluoreszenzmikroskopisch auf Einzelmolekülniveau beobachtet (Kooperation mit Martin Hof, Akademie der Wissenschaften, Prag, Tschechische Republik). Wir haben gefunden, dass OxPl auf verschiedenen subzellulären Ebenen wirken. Die Ergebnisse und die neu entwickelten Methoden aus diesem höchst interdisziplinären Projekt haben bereits zu Folgestudien geführt, die helfen sollen, die verschiedenartigen Mechanismen der Lipidtoxizität molekular zu verstehen.