Synthesis of Selenium-modified RNA by engineered polymerases

RNA is traditionally associated with the translational apparatus and is classified into three main categories that are mRNA, tRNA, and rRNA. However, in recent years, the important role of non-protein encoding RNAs (ncRNAs) has been recognized. The great number of ncRNAs and the growing interest into their functions are accompanied by the increasing demand for structural characterization. By far the most important method for nucleic acid structure determination is X-ray crystallography. Once crystals of a novel RNA have been grown and diffraction patterns recorded, phasing of the data can be a serious obstacle. To efficiently achieve this, modern techniques are available that require anomalous scattering centres within the respective RNA crystal. There are several options; one of them refers to Se-modified RNA whose chemical synthesis has been developed by one of us. However, preparation of Se-RNA by chemical solid-phase synthesis is highly time-consuming and the limitation with respect to the size of RNA represents another serious drawback at present. To overcome these hurdles we aim to develop an enzymatic synthesis strategy for Se-RNA using engineered RNA polymerases. By combining the strengths in organic chemistry, biotechnology and biochemistry of both groups in ribonucleotide synthesis and directed evolution of nucleic acid modifying enzymes, we will evolve new RNA polymerases that synthesize Se-modified RNA efficiently. Only in a collaboration of both groups the required broad methodologies and knowledge that are needed for the success of this project are available. While one group will put forward the chemical synthesis of 2`- methylseleno-modified triphosphates the other group will develop new means for the generation of RNA polymerase variants that accept the chemical modified nucleotides as substrate. The anticipated systems will provide large numbers of long RNAs that contain 2`-methylseleno-modified nucleotides for Xray analysis in an unprecedented short time span and thus spur progress along these lines.

Im Rahmen des ERA Chemistry-Projekts Enzymatische Synthese Selen-modifizierter RNA mittels maßgeschneiderter Polymerasen wurden im österreichischen, durch den Wissenschaftsfond FWF geförderten Projektteil, die chemischen Synthesen der entsprechenden Selen-modifizierten Ribonukleosid-Triphosphate erfolgreich entwickelt (Forschungsgruppe Micura, Universität Innsbruck). In ihrer Funktion als Substrate waren sie die Voraussetzung für die ebenfalls erfolgreiche verlaufene Evolution von RNA-Polymerasen mit erhöhter Toleranz für 2-Modifikationen im deutschen, durch den DFG geförderten Projektteil (Forschungsgruppe Marx, Universität Konstanz). RNA wird traditionell mit dem zellulären Translationsapparat in Verbindung gebracht und in Boten-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA), und ribosomale RNA (rRNA) klassifiziert. Erst in den letzten Jahren wurde die bis dahin unterschätzte Rolle von nicht-Protein kodierender RNA (ncRNA) erkannt. Das steigende Interesse an ihrer Funktion ist mit einer wachsenden Nachfrage ihrer strukturellen Charakterisierung verknüpft, wobei die wichtigste Methode der Strukturbestimmung von Nukleinsäuren die Röntgenstrukturanalyse darstellt. Sobald gut streuende Kristalle erhalten sind kann allerdings das Phasieren der Daten eine wesentliche Hürde darstellen. Um dies effizient zu erreichen, benötigt man RNA-Kristalle mit anomalen Streuungszentren. Zum Erhalt dieser gibt es mehrere Optionen; eine davon bezieht sich auf Se-modifizierte RNA, deren rein chemische Synthese bereits früher von uns entwickelt wurde. Die Darstellung von Se-RNA durch chemische Festphasensynthese ist aber aufwendig und weist eine Limitation in Bezug auf die Größe der RNA auf. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde im durchgeführten Projekt eine enzymatische Synthesestrategie für Se-RNA entwickelt, und zwar unter der Verwendung von maßgeschneidert evolvierten RNA Polymerasen. Durch die Kombination der Stärken beider Gruppen in organischer Chemie, Biotechnologie und Biochemie in Ribonukleotidsynthese und gerichteter Evolution von Nukleinsäure-modifizierenden Enzymen konnte eine neue RNA Polymerase evolviert werden, die effizient Se-modifizierte RNA synthetisiert. Nur in der Kombination beider Gruppen war die erforderliche breite Methodik und das Wissen garantiert um dieses Projektvorhaben zum Erfolg zu führen. Während eine Gruppe die Synthese von 2-methylseleno modifizierten Nukleosidtriphosphaten durchführte, entwickelte die andere Gruppe eine neue Generation von RNA Polymerasen, die die chemisch modifizierten Nukleotide als Substrate akzeptiert. Das erhaltene System steht nun für den effizienten Zugang zu langen RNAs mit Se-modifizierten Nukleosiden für die Röngtenkristallstrukturanalyse in einer bisher unerreicht kurzen Zeitspanne zur Verfügung.