Molekulare Mechanismen für die Erkennung von endozytotischer Fracht

Alle lebenden Zellen müssen die Anzahl an Proteinen und anderen Komponenten an ihrer Oberfläche streng kontrollieren. Die sogenannte Endozytose ist ein spezieller Mechanismus, der selektiv Material aus der Zelloberfläche in das Zellinnere transportiert. In Pflanzen hängt der Haupttyp der Endozytose vom Hüllenprotein Clathrin ab. Dieses Protein hilft den endozytotischen Vesikeln bei der Bildung an der Plasmamembran. In Pflanzen ist die Clathrin-vermittelte Endozytose der wichtigste Mechanismus, um die Menge von Rezeptoren, Transportern, Kanälen und anderen Proteinen mit Funktionen in der Hormonerkennung, Immunität, Nährstoffaufnahme und Entwicklung, an der Zelloberfläche und damit ihre Aktivität zu kontrollieren. Obwohl dieser Prozess von entscheidender Bedeutung ist, sind die Maschinerie und pflanzen-spezifischen Modifikationen der Clathrin-vermittelten Endozytose größtenteils unbekannt. Der erste und entscheidende Schritt in der Clathrin-vermittelten Endozytose ist das Erkennen der Fracht an der Plasmamembran durch Adapterproteine (AP). Der AP-2 Clathrin Adapterkomplex wurde in der Modellpflanze Arabidopsis identifiziert. Dort wurde gezeigt, dass es die Endozytose von bekannten und für die Entwicklung wichtigen Frachtproteine reguliert, den PIN Transporter des Pflanzenhormons Auxin und den Rezeptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1 (BRI1) für das Pflanzenhormon brassinosteroid. Allerdings warten noch wichtige Fragen auf Klärung: (i) wie wird Fracht von AP-2 selektiv rekrutiert; (ii) welche weiteren Regulatoren spielen in diesem Prozess eine Rolle; (iii) welche posttranslationalen Modifikationen an Cargo-Proteinen sind für das Recruitment durch AP-2 notwendig; und (iv) welche Rolle in der Entwicklung und Physiologie spielen das AP-2- vermittelte Recruitment von Cargo und Clathrin-vermittelte Endozytose. Projektziel ist die Proteine zu finden, die mit der Clathrin Maschinerie verbunden sind. Dies geschieht mittels Immunpräzipitation gefolgt von Massenspektrometrie-Proteomik des AP-2 Komplex. Danach werden wir hochauflösende live-Bildgebung und Methoden der Elektronenmikroskopie etablieren um die Interaktion zwischen Adapterproteinen und ausgewähltem Cargo (veranschaulicht durch BRI1 Rezeptor und PIN Transporter) in vivo zu untersuchen. Wir werden diese fortgeschrittenen bildgebenden Verfahren verwenden um die Dynamik der endozytotischen Maschinerie von Pflanzen zu verfolgen, einschließlich der Adapter, neu identifizierten Regulatoren und den Frachten. Wir werden auch konditionale Knockout- Mutanten erzeugen um die Funktion der neuen Clathrin akzessorischen Proteine in der Endozytose und in Signalprozessen zu untersuchen, darunter in der brassinosteroid- und auxin-vermittelten Physiologie. Dieses genetische Material bildet auch die Basis für zukünftige breitere Studien zur Rolle von Clathrin-vermittelter Endozytose und Frachtenrekrutierung in einer Vielzahl von Entwicklungs- und physiologischen Prozessen in Pflanzen, darunter in der Verteidigung gegen Schädlinge und der Aufnahme von Nährstoffen. Dieses Projekt nutzt die komplementäre Expertise der beteiligten Labors: (i) Proteomik und Biochemie Expertise des Russinova Labors (VIB-UGent) und (i) Zellbiologie und modernste Bildgebung des Friml Labors (IST Austria). Dazu erlauben uns die verbundenen aber unterschiedlichen Interessen an Hormon-Wahrnehmung und Signalgebung (Russinova) und an Hormon-Transport und Polarität (Friml), dass wir uns auf die favorisierten Themen konzentrieren und gleichzeitig die Expertise und Tools der individuellen Partnern maximal teilen.

Damit Pflanzen wachsen können, müssen ihre Zellen Signale aus ihrer Umgebung wahrnehmen. Diese Wahrnehmung und auch Nährstoffaufnahme wird durch Proteine auf der Zelloberfläche gesteuert. Um die Empfindlichkeit der Pflanzen gegenüber diesen Signalen zu steuern, werden diese Signalrezeptorproteine durch einen Prozess namens Endozytose von der Zelloberfläche entfernt. Entscheidend für die Endozytose dieser Rezeptoren sind Adaptorproteine, die diese Rezeptorproteine bei Endozytose-Events binden, damit sie als endozytische Cargo-Pakete von der Zelloberfläche entfernt werden können. Wenn wir also herausfinden, wie diese Adaptoren bestimmte Pakete auswählen, können wir beginnen zu verstehen, wie Pflanzen auf verschiedene Signale reagieren. Die Funktionsweise der Endozytose in Pflanzen ist bisher nicht ausreichend charakterisiert worden. Ein Hauptgrund dafür ist der Mangel an bildgebenden Verfahren, die Endozytose-Ereignisse live und mit ausreichender Auflösung abbilden, um das Geschehen vollständig sichtbar zu machen. Daher haben wir in diesem Projekt mehrere neue Bildgebungsprotokolle entwickelt, die es uns ermöglichten, Endozytose in noch nie dagewesenem Maßstab abzubilden. Mithilfe dieser Methoden konnten wir Fragen zu den Mechanismen der pflanzlichen Endozytose beantworten: Bei der Endozytose wird ein kleiner Bereich der Zelloberfläche nach innen gebogen, sodass eine Kugel entsteht, die ihre Ladung ins Innere der Zelle trägt. Im Feld der Zellbiologie ist seit langem bekannt, dass diese Biegung durch ein Protein namens Aktin verursacht wird. Daher erwarteten wir, dass Aktin für die pflanzliche Endozytose erforderlich ist. Mit unseren neuen bildgebenden Verfahren konnten wir jedoch zeigen, dass diese Vorhersage falsch war und dass die pflanzliche Endozytose im Vergleich zu anderen biologischen Modellen anderes funktioniert. Um zu untersuchen, wie Rezeptoren für die Endozytose ausgewählt werden und wie die Endozytose das Pflanzenwachstum reguliert, haben wir uns auf die Untersuchung eines wichtigen Signalrezeptors für Wachstum - BRI1 - konzentriert. Wir identifizierten eine spezifische Proteinsequenz in diesem Rezeptor, die einem bekannten Cargo-Motiv für endozytische Cargo-Adaptoren bei Säugetieren ähnelt. Wir bestätigten, dass diese Sequenz tatsächlich die Interaktion zwischen BRI1 und einem endozytischen Adaptorprotein (AP2) vermittelt. Danach nutzten wir unsere bildgebenden Verfahren, um zu zeigen, dass diese Beziehung funktionsfähig ist und identifizierten einen Erkennungsmechanismus für die Endozytose-Pakete in Pflanzen. Um weitere Adaptorproteine zu untersuchen, studierten wir die Rolle eines vorhergesagten pflanzenspezifischen Adaptors, des TPLATE-Komplexes. Bei unseren Untersuchungen stellten wir fest, dass der TPLATE-Komplex außerhalb von Endozytose-Events lokalisiert ist, was darauf hindeutet, dass er eigentlich nicht als endozytischer Cargo-Adapter fungiert. Mithilfe einer Reihe von biochemischen, bildgebenden und biophysikalischen Ansätzen fanden wir stattdessen heraus, dass der TPLATE-Komplex für die Biegung der Zelloberfläche während der Endozytose entscheidend ist. Damit wurde der erste Teil der einzigartigen pflanzlichen Endozytose-Maschinerie identifiziert. Insgesamt haben unsere Ergebnisse aus diesem Projekt zu einer bedeutenden Erweiterung der pflanzlichen Endozytose-Modelle geführt und viele Erkenntnisse über die Regulierung von Proteinen geliefert, die das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen regulieren.