RNA arrays: die nächste Generation

RNA als das Bindeglied zwischen der genetischen Information in Form von DNA und Proteinen als Produkt der Genexpression ist, wie auch DNA, eine Nukleinsäure, also ein Biopolymer, das aus vier verschiedenen Bausteinen (A, C, G und U) besteht, die in einer ganz bestimmten Reihenfolge, der so genannten Sequenz, miteinander verbunden sind. Aber RNA dient nicht nur der Speicherung von Informationen in Form eines Codes unter Verwendung des genetischen Alphabets, ihre Struktur und dreidimensionale Form erlaubt es ihr, ein chemisch aktives Molekül zu werden, das in der Lage ist, Reaktionen durchzuführen und an ein breites Spektrum von Zielmolekülen zu binden. Die funktionelle Vielfalt der RNA macht sie daher zu einer idealen Nukleinsäure, um neue Bindungsmotive zu identifizieren und zu untersuchen, wie die Zielerkennung funktioniert. Typischerweise erfordert dies die Herstellung von Sequenzvarianten, die, wenn alle RNA-Basen an jeder Position permutiert werden müssen, bald Zehn- und Hunderttausende RNA- Sequenzen ausmachen. Die einzige verfügbare Methode, die diese Anforderungen erfüllen kann, ist die Microarray-Synthese. Die Microarray-Synthese ermöglicht die parallele Synthese sehr großer Bibliotheken von Nukleinsäuresequenzen auf einer einzigen Oberfläche, wobei jede Sequenz an einer exakt definierten Position lokalisiert ist. In unserem Labor verwenden wir UV-Licht, um die Synthese von DNA-Sequenzen in einem Prozess namens Photolithographie zu steuern, und vor kurzem konnten wir unser Repertoire auf die RNA-Synthese ausweiten. Ziel dieses Projekts ist die Erstellung eines völlig neuen Satzes von Bausteinen, durch deren Einsatz eine schnellere und effizientere Synthese von RNA ermöglicht, die derzeitigen Längenlimitationen überwunden und der Abbau der Zielmoleküle minimiert werden soll. Dazu werden wir spezielle RNA-Bausteine (Phosphoramidite) verwenden, deren Einsatz in der Standard- Synthese von RNA-Oligonukleotiden bereits Produkte hoher Reinheit ermöglichte, und sie durch Anpassung ihrer molekularen Struktur in lichtempfindliche Moleküle umwandeln. Dabei werden sie mit der sensitivsten, mit der Methode kompatiblen, Schutzgruppe ausgestattet, worin der Schlüssel zur Verkürzung der gesamten Synthesezeit liegt. Der Zugang zu längeren RNA-Oligonukleotiden von höherer Qualität erlaubt die Erstellung komplexer Bibliotheken von RNA-Sequenzen auf einem einzigen Microarray, um die Bindungseigenschaften fluorogener Aptamere zu untersuchen. Aptamere sind Strukturen, deren 3D-Faltung es ermöglicht, an Zielmoleküle zu binden. Im Falle fluorogener Aptamere führt eine Bindung von RNA und Zielmolekül zum Leuchten des Komplexes, eine besonders nützliche Technik für die Überwachung von RNA in vivo. Auf Arrays synthetisierte RNA-Bibliotheken werden auch in der direkten RNA-Sequenzierung getestet. Das Projekt ist eine Zusammenarbeit zwischen Dr. Jory Lietard vom Institut für Anorg anische Chemie der Universität Wien und Dr. Francoise Debart von der Universität Montpellier.

Ziel des Projekts war das Verfahren zur Herstellung von RNA-Mikroarrays voranzutreiben. Microarrays sind physikalische Objekte, bei denen eine Reihe einzigartiger Moleküle auf einer flachen Oberfläche angebracht sind, wobei jedem Molekül ein bestimmter Platz auf dieser Oberfläche zugewiesen wird. DNA-Mikroarrays sind weit verbreitet und im Handel erhältlich, aber RNA-Mikroarrays sind wesentlich schwieriger herzustellen. Wegen ihres großen Potenzials, biologisch relevante Fragen im Hochdurchsatzverfahren zu beantworten, wollten wir ein schnelles und effizientes Verfahren zur Herstellung von RNA-Mikroarrays entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir uns mit der Gruppe von Françoise Debart (Universität Montpellier, Frankreich) zusammengetan, die die notwendigen Reagenzien für die Synthese von RNA-Mikroarrays bereitstellte. Ihre Gruppe entwickelte eine Reihe neuartiger RNA-Bausteine, die den Prozess des Zusammenfügens dieser Bausteine zum Aufbau eines RNA-Moleküls beschleunigen sollten. Sie enthielten eine lichtempfindliche Gruppe, die die Integration in unser Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays (Photolithographie) ermöglichte. Diese neuen RNA-Bausteine, PrOM-Phosphoramidite genannt, wurden in der Microarray-Photolithographie getestet. Wir konnten RNA-Mikroarrays viel schneller herstellen als zuvor, da der Zusammensetzungsprozess ("Kopplung") nun doppelt so schnell und die Lichtempfindlichkeit viermal so hoch ist. Wir stellten auch fest, dass die Qualität insgesamt besser war, da die RNA-Moleküle weniger abgebaut wurden. Diese Studie zur technischen Verbesserung gipfelte in der Herstellung von RNA-Mikroarrays mit Hunderttausenden einzigartiger RNA-Sequenzen, die alle in einem ~1,4 cm großen Bereich enthalten sind, und zwar in etwas mehr als 3 Stunden Synthesezeit und sehr nahe an der Zeit, die man für die Synthese einer DNA-Version desselben Mikroarrays benötigen würde. Wir untersuchten auch Anwendungen für RNA-Mikroarrays. In einem speziellen Fall untersuchten wir so genannte fluorogene RNA-Aptamere. Dabei handelt es sich um RNA-Sequenzen, die an kleine Moleküle binden können, wobei die resultierende Bindungsinteraktion ein fluoreszierendes Signal erzeugt. Diese Aptamere werden für die Verfolgung von RNA in Zellen verwendet. Wir konnten eine sehr komplexe Bibliothek von fluorogenen Aptameren auf Mikroarrays entwerfen und untersuchen, wie Veränderungen in der RNA-Sequenz zu einer verminderten Fähigkeit führen, zu binden und ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen. Diese Arbeit zur systematischen Sequenzmodifikation unterstreicht den großen Wert von DNA- und RNA-Mikroarrays: eine Bibliothek von RNA-Sequenzen, die zur gleichen Zeit synthetisiert werden und im gleichen Objekt enthalten sind, so dass ein einziges Experiment erforderlich ist, um jedes Mitglied der Bibliothek gleichzeitig mit hoher Fluoreszenz abzufragen. Künftige Arbeiten werden sich auf die Herstellung längerer RNA-Sequenzen und die Erforschung weiterer Bindungsinteraktionen konzentrieren.