Neue Formen von Interleukin Rezeptor Signalisierung

Interleukine sind wichtige Signal-Proteine, welche von Zellen des Immunsystems ausgeschüttet werden, um mit benachbarten Zellen zu kommunizieren. Eines dieser Interleukin-Proteine, das Interleukin-2, steht im Fokus unseres Projektes. Interleukin-2 wird von T Helferzellen ausgeschüttet, und wirkt als sogenanntes autokrines Hormon zum Teil auch auf die ausschüttende Zelle selbst zurück. Dieses Signal wird von der T-Zelle parallel zu vielen anderen Eingangs-Signalen verarbeitet, und ist damit für den Ausgang der Immunantwort mitbestimmend. Interleukin-2 wird vom Interleukin-2 Rezeptor, einem Membran-Protein der T-Zelle, gebunden. Bisher ging man davon aus, dass die Bindung vor allem an der Plasmamembran der T Zelle erfolgt. Daten unseres ungarischen Kollaborationspartners deuten jedoch darauf hin, dass die Bindung vorwiegend in intrazellulären Organellen wie dem Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi Apparat geschieht, jedoch konnten diese intrazellulären Bindungen aufgrund ungenügender Auflösung der bildgebenden Verfahren bisher nicht mittels Mikroskopie bestätigt werden. In diesem Projekt versuchen wir, die beiden Proteine also das Interleukin-2 sowie den Interleukin-2 Rezeptor gleichzeitig mittels hochauflösender Mikroskopie zu beobachten. Wir werden uns dazu der einzelmolekularen Lokalisationsmikroskopie bedienen, welche darauf beruht, einzelne Farbstoffmoleküle sehr genau im zellulären Kontext zu lokalisieren. Die Methode kann eine Auflösung im Bereich weniger zehn Nanometer erzielen, was einer circa zehnfachen Verbesserung im Vergleich zu herkömmlicher Lichtmikroskopie entspricht. Die beiden Proteine werden über Antikörper spezifisch mit Farbstoffen markiert, und über Zweifarb-Mikroskopie untersucht. Darüber hinaus werden wir versuchen, die Dynamiken der Proteine im zellulären Kontext zu erfassen. Dazu werden wir einzelne farbstoffmarkierte Rezeptor-Proteine bei ihrer 3-dimensionalen Bewegung innerhalb der Zelle mittels hochauflösender Mikroskopie beobachten. Zusammengenommen soll das Projekt neues Licht auf die räumlich-zeitliche Abfolge der Interleukin- 2 Bindung und damit auf einen für die Immunantwort wesentlichen Prozess werfen.

Interleukin-2 (IL-2) und -15 (IL-15) sind wichtige Regulatoren der Aktivierung, der Homöostase, der Proliferation und des Überlebens von T-Zellen, die eine zentrale Rolle bei adaptiven Immunreaktionen gegen Krankheitserreger und Krebs spielen. Die Rezeptoren für IL-2 und IL-15 bestehen aus jeweils 3 Untereinheiten, von denen 2 identisch sind. Deshalb haben IL-2 und -15 mehrere gemeinsame Funktionen, wie z. B. die Förderung der T-Zell-Proliferation; interessanterweise sie spielen beim immunologischen Gedächtnis gegensätzliche Rollen. Das immunologische Gedächtnis beruht auf dem langfristigen Überleben von T-Zellen, so dass das Immunsystem bei wiederholtem Zusammentreffen mit demselben Krankheitserreger eine prompte Antwort geben kann. IL-15 ist der wichtigste Überlebensfaktor von T-Gedächtniszellen, der über Transpräsentation (TP) wirkt, die auf der Interaktion zwischen einer antigenpräsentierenden Zelle und der T-Zelle beruht. In diesem Projekt wollten wir hochauflösende, einzelmolekulare Mikroskopie verwenden, um die Organisation von IL-2 und I-15 Rezeptoren in zellulären Membranen zu studieren. Das Projekt wurde in enger Zusammenarbeit mit unseren Kollabortionspartner György Vamosi von der Universität Debrecen, Ungarn, durchgefürhrt. Wir verfolgten 2 hauptsächliche Stoßrichtungen: 1.) Wir verwendeten einzelmolekulares Tracking, um die Bewegung von IL-2 in nativen Zellen sowie sogenannten Membran-Blebs zu vergleichen. Blebs weisen kein Aktin-basiertes Zytoskelett auf, daher sollte unterschiedliches Diffusionsverhalten Aufschluss geben über den Einfluss des Zytoskeletts auf die Beweglichkeit der Proteine. Die Experimente zeigten, dass die Bewegung IL-2 in Blebs im Vergleich zur zellulären Plasmamembran massiv beschleunigt ist. Zusammen mit den Ergebnissen unserer Partner aus Debrecen konnten wir zeigen, dass auf der molekularen Ebene die Komplexe aus IL-2/15 Rezeptoren (sowie MHC) sowohl in Blebs als auch in nativen Membranen vorhanden sind, jedoch den Kontakt zum Aktin Zytoskelett verlieren. Eine Organisation zu größeren Mikrodomänen dieser Rezeptor-Cluster konnten wir in der Plasmamembran beobachten, aber sie verschwand weitgehend in Blebs. 2.) Wir haben bereits vor vielen Jahren eine Methode namens TOCCSL entwickelt, um Ko-Diffusion von Proteinen in Zell-Membrane quantitativ zu studieren. Hier wollten wir diese Method anwenden auf die Interaktionsstudie zwischen IL-2 und IL-15 Rezeptoren. Bevor wir dieses Experiment in Angriff nehmen konnten, war es jedoch notwendig, die Methode selbst genauer auf mögliche Abweichungen in den erzielten Ergebnissen zu untersuchen. Daher führten wir sehr genaue Monte Carlo Simulationen durch, in denen wir die Methode am Computer nachstellten und genau quantifizierten, wie verschiedene experimentelle Parameter die erzielten Ergebnisse beeinflussen. Diese Ergebnisse können sehr gut als Basis für zukünftige TOCCSL Experimente dienen.