Aufklärung der DFR Substratspezifität

Die Dihydroflavonol 4-Reduktase (DFR) ist ein Schlüsselenzym in der Flavonoid-Biosynthese in Pflanzen und katalysiert die Bildung der Vorstufen der Anthocyan-Farbstoffe. Die natürlichen Substrate für die DFR sind Dihydrokämpferol, Dihydroquercetin und Dihydromyricetin, welche sich durch eine unterschiedliche Anzahl an Hydroxylgruppen (OH-Gruppen) im sogenannten B-Ring ihrer chemischen Struktur unterscheiden. Die Substratspezifität der DFRs kann variieren, wobei manche DFRs alle drei Substrate gleichermaßen akzeptieren, während andere eine hohe Spezifität für bestimmte Substrate aufweisen. Da die Anzahl an OH-Gruppen in den Substraten die Farbe der Anthozyane bestimmt, ist die Substratspezifität der DFR ein entscheidender Faktor bei der Ausprägung von unterschiedlichen Blüten- oder Fruchtfarben. Die Substratspezifität wird durch geringfügige Unterschiede in der Aminosäuresequenz im Bereich der Substratbindungsstelle und damit leicht veränderten Struktur des Enzyms bestimmt. Obwohl zur Substratspezifität der DFR bereits zahlreiche Studien verfügbar sind, gibt es bislang kein systematisches Verständnis, wie genau diese Spezifität auf molekularer Ebene der Aminosäuresequenz festgelegt ist. Ziel ist es, die Beziehung zwischen Struktur und Funktion der DFR in Bezug auf ihre Spezifität zu den drei Substraten herzustellen. Im Projekt werden verschiedene DFRs aus Pflanzen in Bakterienkulturen hergestellt und mit Enzymtests auf ihre Substratspezifität untersucht. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den jeweiligen Aminosäuresequenzen im Bereichder Substratbindungsstelle gesetzt. Insbesondere die DFR aus der Weinrebe ist dabei von Bedeutung, da hiervon die Kristallstruktur des Enzyms bekannt ist. Dies ermöglicht die komplementäre Kombination von in silico-Techniken (theoretische Enzym-Modellierung mittels spezieller Software) mit experimentellen Daten der Enzymtests. So können Auswirkungen auf Änderungen in der Aminosäuresequenz vorausgesagt und experimentell überprüft werden, sowie umgekehrt aufgrund der Aminosäuresequenzen die entsprechende Substratspezifität im Modell abgeleitet werden. Unterstützt wird dies durch die Erzeugung von Punktmutationen im Enzym, wo gezielt einzelne oder mehrere Aminosäuren im Bereich der Substratbindungsstelle ausgetauscht und die Auswirkung auf die Substratspezifität bestimmt werden. Letztendlich soll es möglich sein, die Substratspezifität auf Basis der Aminosäuresequenzinformation vorherzusagen.DasgenauVerständnisder Substratspezifität auf Ebeneder Aminosäuresequenz trägt wesentlich zur gezielten Züchtung von Pflanzen mit neuen Blüten- und Fruchtfarben bei. Des Weiteren befasst sich das Projekt mit der Evaluierung verschiedener DFR-Enzymtests um robuste und vergleichbare Ergebnisse innerhalb der Forschungscommunity zu ermöglichen.