Einzel-Molekulare mechanische und biophysikalische Eigenschaften des VWF

Von Willebrand Faktor (VWF) ist ein langes Filament-Protein, mit verschiedenen Domänen, die zur Entfaltung, zur Adhäsion und zur Abspaltung wichtig sind. Die Länge und die Adhäsion des mechanisch sensitiven VWF werden durch die Scherrate im Blutstrom eingestellt und machen VWF so zu einem molekularen Scherkraftsensor. Die Kenntnis der durch die (Scher)kraft beeinflussten molekularen Mechanik und der Funktion der Domänen des VWF ist ein Schlüssel zum genauen physiologischen Verständnis von Blutstockung und -gerinnung. Einzelmolekulare Kraftexperimente mit einem Kraftmikroskop (AFM) sind besonders geeignet Bindungskräfte und mechanische Eigenschaften von Abschnitten dieser molekularen Kette mit einer Genauigkeit von wenigen Piko Newton zu erforschen. Molekulare Erkennungs- und Adhäsionskräfte sowie die Faltungs- und Entfaltungskräfte der VWF-Domänen aber auch die Kräfte, die für die enzymatische Aktivität erforderlich sind, werden mittels dynamischer Kraftmikroskopie gemessen. Zusätzlich wird die Wechselwirkung von VWF mit Zellen (Blutplättchen und Gefäßwandzellen) sowie die widersprüchlich diskutierte Freisetzung des am VWF gebundenen Faktors VIII untersucht. Das Projekt ist eingebunden in einem starken interdisziplinären Umfeld. Insbesondere werden definierte Oligomere des VWF und Konkatemere von VWF-Domänen sowie gezielte Punktmutationen und pathologische Mutationen vom Typ 2 zu Verfügung gestellt. Durch Kraftmessungen an diesen Proben wird ein genaues Bild über Struktur und Funktion des VWF in Hinblick auf seine adhäsiven und mechanischen Eigenschaften entstehen. Durch zusätzliche Messungen (force-mapping und recognition-imaging (TREC)) an lebenden Zellen werden Rezeptorbindungsdomänen für VWF nanometergenau auf den Zelloberflächen von Blutplättchen und Gefäßwandzellen vermessen. Das fundierte Hintergrundwissen über AFM-techniken und die lange Erfahrung mit Zelladhäsionskraftmessungen ergänzen sich in diesem Projekt komplementär, für das hochauflösende topographische Abbilden und die Lokalisierung von Bindungsstellen, sowie einzelmolekulare Bindungsexperimente und Zell-zelladhäsionskraftmessung als auch die Kraftmessungen zur Proteinentfaltung.

Der von Willebrand Faktor (VWF) ist ein Protein, das eine essentielle Rolle in der Blutgerinnung spielt. Der VWF hilft bei der Bindung von Blutplättchen, welche die Blutung durch Verklumpen stoppen, an freigelegte Kollagenschichten in der Wunde und führt so zum Wundverschluss. Kollagenbindungsstellen befinden sich in den VWF Domänen A1 und A3, wobei Kollagen Typ III hauptsächlich mit Domäne A3 und Kollagen Typ VI mit Domäne A1 interagiert. Die Kräfte und das dynamische Verhalten dieser Wechselwirkungen wurden in dieser Studie mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) erforscht. Mit dieser Methode kann die Bindung zwischen einzelnen Molekülen untersucht werden. Im Rahmen dieses Projekts klärten wir die grundlegenden ersten Schritte der Blutgerinnung, die Wechselwirkung zwischen VWF und Kollagen, auf. Dabei erforschten wir die klinische Relevanz von drei Mutationen (S1731T, Q1734H und H1786R) in der A3 Domäne des VWFs, in Bezug auf ihre Kollagenbindung. Interaktionen zwischen Kollagen Typ III und VI und der S1731T Mutante zeigten keine signifikante Veränderung der Bindungsstabilität im Vergleich zu dem Konstrukt ohne Mutation. Diese Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass Patienten, die diese Mutationen in sich tragen, keine oder nur eine leichte Blutungsneigungen zeigen. Die Mutationen Q1734H und H1786R formten einen leicht stabileren Komplex mit Kollagen III, wahrscheinlich wegen der Ausbildung von zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindungen. Die gleichen Mutanten zeigten auf Kollagen VI eine drastische Erhöhung der Bindungsstabilität. VWF Domäne A1 ist bekannt als die Hauptbindungsstelle für Kollagen Typ VI. Daher folgerten wir, dass die VWF A1 Domäne bei vorhandener A3 Mutation stärker an Kollagen VI bindet und so die defekte Bindung der A3 Domäne kompensiert. Dieses Verhalten könnte das unauffällige Blutungsverhalten von Patienten mit diesem Mutationen erklären. Es scheint, dass defekte VWF/Kollagen Interaktionen durch alternative Bindungen kompensiert werden können. Zusätzlich zur Kollagenbindung ist die VWF Domäne A1 auch für die Adhäsion von Blutplättchen mittels Blutplättchen Rezeptor GPIb? verantwortlich. Die benachbarte A2 Domäne wird unter Scherung im Blut entfaltet, wobei eine Spaltstelle freigelegt wird. An dieser Stelle kann der VWF zerkleinert werden um ungewollte Thrombosen zu verhindern. Im unverletzten Zustand kann der VWF keine Blutplättchen binden. Dieses Verhalten wurde mit einem unbekannten Abschirmungsmechanismus der GPIb? Bindungsstelle in der VWF A1 Domäne durch Domäne A2 verbunden. Aus diesem Grund untersuchten wir die Stärke der Interaktion zwischen A1 und A2 und das Entfaltungsverhalten der A2 Domäne. Die Domäne A2 blieb während der Trennung von A1 hauptsächlich gefalten und somit geschützt vor einem frühzeitigen Abtransport.Diese Arbeit wurde im Rahmen des Projekts SHENC (Shear flow regulation of HEmostasis - bridging the gap between Nanomechanics and Clinical presentation) durchgeführt. Unser Unterprojekt beschäftigte sich mit Interaktionsstudien zwischen einzelnen Molekülen.