Rare-G

Bei unseren Voruntersuchungen haben wir einen potenziellen neuartigen Mikro-RNA(miR)-kontrollierten Pfad für die Pathogenese der primären fokal segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) identifiziert. Bei miRs handelt es sich um kurze Nukleotide, die die Exprimierung von Genen in zellspezifischer Art und Weise unterdrücken. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Deletion der miR-Funktion in Podozyten (Knock-out von Dicer oder Drosha) eine spezielle Form der FSGS hervorruft, allerdings wurde bisher keine einzige pathogene miR gefunden. Bei unseren Voruntersuchungen haben wir die erste miR (miR193) identifiziert, die die komplexe Struktur von Podozyten reguliert. Experimentell nachgewiesen wurde folgendes: a. Transgene Doxycyclin-induzierbare Überexpression von miR193 bei Mäusen ruft nephrotische Proteinurie und primäre FSGS hervor. b. In silico- Analysen der von miR193 regulierten Gene (unter Verwendung des Ingenuity Programms oder des transkriptomen Vergleichs von miR193 überexprimierenden Mäusen mit Kontrollmäusen) identifizierten - unter anderen regulierten Genen - WT-1, uPA, TGFb1 und 2 (die bekanntlich bei FSGS eine Rolle spielen). Zusätzlich wurden mehrere Gene des EGF-Signalpfades, einschließlich ADAM and Matrix-Metalloproteasen, und Komponenten des EGF "down-stream" Signalpfades (PI3K Pfad und SOS2 (Grb/Ras)) identifiziert. c. miR193 wurde in mikrosezierten Glomeruli von FSGS-Patienten differenziert reguliert. Interessanterweise war dies auch bei Patienten mit Denys-Drash-Syndrom der Fall, wo eine Mutation des Transkriptionsfaktors WT-1 FSGS hervorruft. Die Doxycyclin-induzierbare Überexpression von miR193 in Mäusen unter dem allgegenwärtigen CMV-Promotor ist bereits etabliert. Glomeruli werden mittels Perfusion mit Dynabeads isoliert, die Extraktion der Total-RNA erfolgt für die Downstream-Analyse der regulierten Transkripte im Glomerulus in vivo. Alternativ werden Gen- getagte primäre Podozyten, die transgen beta-Galactosidase oder eGFP exprimieren, mittels FAC-Sorting isoliert. Total miR wird wie oben beschrieben isoliert, analysiert und auf miR193 hin quantifiziert. mRNA wird aus den Glomeruli isoliert und unter Verwendung des Affymetrix GeneChip Mouse Chip 1.0 ST Array einem Genexpressionsarray unterzogen. Diese Studien werden an gesunden und erkrankten Mäusen durchgeführt, bei denen FSGS durch 5/6-Nephrektomie + DOCA-Salz-Modell induziert wurde. Das Genexpressionsmuster wird unter Verwendungen der GeneSpring und Ingenuity Software bioinformatisch analysiert. Zur Identifizierung der miR193-Targets wird die stabil transfizierte, konditional immortalisierte Maus-Podozyten Zelllinie (freundlicherweise von Mundel bereitgestellt) bzw. werden frisch transfizierte primäre Podozyten eingesetzt. Es erfolgt die lentivirale Transduktion von miR193; die mRNA wird extrahiert und mittels Affymetrix mouse Gene Chips (Mouse Chip 1.0 ST Array) einem Genexpressionsarray unterzogen. Komponenten des EGF- Systems, sowie vom EGF-System regulierte Gene sind bei dieser Analyse von besonderem Interesse. miR193- überexprimierende kultivierte primäre Podozyten oder Podocyten Zelllinien werden auf Zell-Turnover (sowohl Mitose- als auch Apoptoserate), Expression (mittels qPCR) und Lokalisierung (mittels Immunfluoreszenz) von Schlüssel-Podozytenproteinen des Zytoskeletts (Actin, Actinin, Tubulin), des Nephrin-assoziierten Schlitzmembran-Komplexes (Nephrin, CD2ap), der Matrixadhäsion (a3b1-Integrin) und der Zelloberfläche (Podocalyxin) hin getestet. Ein Archiv von Nierenbiopsien von Tausenden Patienten und klinische Daten werden uns die Umsetzung der grundlegenden Ergebnisse in den Klinikbereich ermöglichen. Die wichtigsten pathologischen Einheiten stellen FSGS und, als Kontrolle, Minimalerkrankungen sowie andere Glomerulopathien und gesunde Glomeruli dar. Glomeruli werden mittels Laser Capture Mikrodissektion aus archivierten Paraffinschnitten isoliert, die Extraktion und Quantifizierung der miR193 erfolgt wie zuvor beschrieben. Unter Anwendung genetischer Mausmodelle für FSGS setzt sich dieses Programm mit der ersten Identifizierung eines neuartigen, miR-basierten Regulationsmechanismus für die Podozytenstabilität auseinander, der mehrere regulierte Zellpfade, einschließlich jenem des EGF-Systems, umfasst. Die bereits in Vorstudien erhobenen Resultate bilden die Grundlage einer gezielten Therapie der häufig sporadisch auftretenden Form der FSGS beim Menschen.

Wir analysierten die Rolle der microRNA-193a (miR-193a) in der Fokal Segmentalen Glomerulosklerose (FSGS). FSGS ist die häufigste glomeruläre Erkrankung in Erwachsenen, sie führt ohne erfolgreiche Therapie zu irreversiblen Schädigungen der Nierenglomeruli, den Orten der Blutfiltration und Primärharnproduktion. Der resultierende Nierenschaden ist progressiv und meist therapie-resistent und führt zum nephrotischen Syndrom mit Proteinurie, Hypoalbuminämie und Ödemen, gefolgt von Nierenversagen. Während für eine gewisse Anzahl der FSGS-Fälle genetische Mutationen, Drogen, Viren oder im Blut zirkulierende Faktoren verantwortlich sind, ist die Ursache in der Mehrzahl der Fälle unbekannt. Wir haben miR-193a als relevanten und in vielen FSGS-Patienten erhöhten Faktor identifiziert. miR-193a inhibiert das Target Wilms Tumor 1 (WT1), ein Hauptregulator der Nierenentwicklung und -Homöostase. Das führt zum Verlust von Nieren-Strukturproteinen und in weiterer Folge zu Nierenversagen. Durch spezifisches Blockieren von miR-193a konnten wir die prinzipielle Möglichkeit eines therapeutischen Ansatzes in diesem Signalweg zeigen. Unsere Arbeit repräsentiert einen großen Schritt vorwärts bezüglich der Identifikation von Auslösern in FSGS-Fällen mit bislang unbekannter Ursache und erstmals einer wirksamen und spezifischen Therapie. Wir haben in Kooperation mit anderen Gruppen Signalwege in der FSGS-Entstehung untersucht und uns auf den neu entdeckten Signalweg der von miR-193a reguliert wird konzentriert.