Selektive Inaktivierung von Neuronen

Ziel dieses Projektes ist die Weiterentwicklung einer Methode zur selektiven Inaktivierung von Nervenzellen mittels Glutamat-gesteuerter Chloridkanäle. Für ein besseres Verständnis der Erkrankungen des Nervensystems (neurologische, psychiatrische und Drogenmissbrauch) ist es wichtig, die Funktion der verschiedenen Typen von Neuronen im zentralen Nervensystem zu kennen. Dieses Wissen wird bei der Entwicklung neuer Therapien helfen. Die Funktion von Nervenzellen wird konventionell durch Inaktivierung mittels pharmakologischer Ansätze oder Läsionen untersucht. Da diese Methoden viele Nachteile haben, versuchen wir, eine Strategie weiterzuentwickeln, bei der Neuronen mit Hilfe Glutamat-gesteuerter Chloridkanäle (GluCl) selektiv inaktiviert werden. GluCl-Kanäle aus dem Fadenwurm (C. elegans) werden in Säugetier-Neuronen eingebracht; ihre Aktivierung durch das Antibiotikum Ivermectin verhindert die Entstehung von Aktionspotentialen und führt somit zu einer reversiblen Inaktivierung ("Silencing"). Diese GluCl-Kanäle bestehen aus einem Heterooligomer von Alpha- und Beta-Untereinheiten. Diese Untereinheiten wurden für unsere Zwecke modifiziert: (i) Die DNA-Codons wurden für eine Expression in Säugetierzellen optimiert. (ii) An die Untereinheiten wurden fluoreszierende Proteine angehängt, um eine direkte Visualisierung zu ermöglichen. (iii) Die Sensitivität für Glutamat wurde durch Mutation der Aminosäure Tyrosin in der Position 182 (Tyr182) zu Phenylalanin deutlich reduziert, ohne die Sensitivität für Ivermectin zu beeinflussen. Um ein hohes Expressionsniveau in Neuronen zu erreichen, werden wir uns für den Gentransfer eines Systems bedienen, das auf Adeno-assoziierten Viren basiert. In einem ersten Schritt werden wir Neuronen aus dem Hippocampus isolieren und infizieren. Durch Messung elektrophysiologischer Aktivitäten nach Zusatz von Ivermectin werden wir die Inaktivierung der Neuronen in Kultur untersuchen und die viralen Konstrukte bei Bedarf verbessern. Anschließend werden diese Viren stereotaktisch in den Hippocampus von Mäusen injiziert. Elektrophysiologische Aktivitäten in Neuronen des Hippocampus werden in Gehirnschnitten aufgezeichnet, um eine Inaktivierung auch im Kontext des intakten Nervensystems zu zeigen. Zusätzlich werden wir Lernfähigkeit und Gedächtnisbildung der injizierten Tiere in Standard-Verhaltenstests untersuchen, da bei Inaktivierung von infizierten Neuronen im Hippocampus darin Defizite zu erwarten sind. Das Verhalten der Tiere kann mit den elektrophysiologischen Daten korreliert werden. Ein langfristiges Ziel dieses Projekts ist die Erzeugung von Tiermodellen für neurologische und psychiatrische Erkrankungen. Diese transgenen Mäuse werden GluCl-Kanäle in spezifischen Typen von Neuronen unter der Kontrolle von Zell-spezifischen Promotoren exprimieren.