Regulation des P. aeruginosa Amidaseoperons durch Hfq

Pseudomonas aeruginosa (PAO1) ist ein humanpathogenes Bakterium, das für seine Resistenz gegenüber einer Vielzahl von medizinisch relevanten Antibiotika bekannt ist. PAO1 verursacht nosokomiale Lungenentzündungen, Harnwegsinfektionen, sowie Blut- und Wundinfektionen. In vorangegangenen Publikationen haben wir gezeigt, dass die Inaktivierung des hfq Genes, das für das Sm-ähnliche Protein Hfq kodiert, zu einer Attenuierung der Virulenz führt. Das Amidaseoperon kodiert für eine aliphatische Amidase, welche die Hydrolyse von kurzkettigen aliphatschen Amiden zur entsprechenden Säure und zu Ammoniak katalysiert und welche zur metabolischen Vielseitigkeit von P. aeruginosa beiträgt. Unsere Transkriptomanalyse ergab, dass das Amidaseoperon in Abwesenheit von Hfq hochreguliert wurde. Der zuvor beschriebene RNA Leader des Amidaseoperons wurde von mir in einem "RNomics" Ansatz als kleine nicht-kodierende RNA (Pae20) identifiziert, die an Hfq bindet. Da an Hfq bindende kleine RNAs in der Regel regulatorische Funktionen aufweisen, ist es vorstellbar, dass diese "Leader RNA" als regulatorischer Faktor auf post-transkriptionaler Ebene wirken kann. Die Hauptaufgabe dieser Studie ist es, mehr Einblick in die Regulation des Amidaseoperons von PAO1 durch Hfq und Succinat und dessen möglichen Einfluß auf die Virulenz zu erhalten. In Gegenwart von Hfq wirkt Succinat als ein starker Katabolitrepressor des Amidaseoperons. Es soll untersucht werden, ob Hfq die Amidaseexpression über eine Inhibierung der Bindung von AmiR, einem positiven Regulator des Amidaseoperons, an Pae20 oder über eine direkte Interaktion mit der amiE mRNA, die für die aliphatische Amidase kodiert, beeinflußt. Translationelle lacZ- Fusionen sowie in vitro Versuche sollen helfen, diese Frage zu klären. Weitere Experimente sollen zeigen, ob kleine nicht-kodierende RNAs in diese Regulation involviert sind. Proteom- und bioinformatische Analysen legen nahe, dass Pae20 auch als unabhängige regulatorische RNA wirkt. Um dies näher zu untersuchen, soll mittels transkriptionalen und translationalen lacZ-Fusionen überprüft werden, ob Pae20 direkt die Expression möglicher Ziel-mRNAs beeinflußt. Von zwei der in silico gefundenen möglichen Pae20 Zielgene, pcrV und truA, wurde gezeigt, dass sie in Zusammenhang mit Typ III-Sekretion und daher mit Virulenz stehen. Um den Einfluß von Pae20 auf Typ III-Sekretion zu überprüfen, soll weiters ein Virulenztest mit HeLa Zellen durchgeführt werden. Die Bedeutung dieses Projekts liegt in der Untersuchung von kleinen nicht-kodierenden RNAs, welche die metabolische Vielseitigkeit und die Virulenz von P. aeruginosa regulieren.