Gerichtete Evolution der Galacotsyltransferase LgtC

Kohlenhydrate haben verschiedenste biologische Funktionen. Ihre außerordentlich unterschiedlichen Strukturen kommen daher, dass verschiedene Monosaccharide zu Glykanen unterschiedlicher Länge, Sequenz und anomerischer Bindungen zusammengesetzt werden können. Die klassische chemische Synthese ist wegen der hohen Anzahl an regio- und stereochemischen Verknüpfungen äußerst arbeits- und zeitintensiv. Eine enzymatische Synthese bietet sich daher als Alternative an. Glycosytransferasen sind die Enzyme, die Glykane in der Natur synthetisieren. Sie eigenen sich daher dank ihrer hohen Regio- und Stereoselektivität auch hervorragend für die in vitro Synthese. Allerdings ist ihre Effizienz in vitro häufig gering und trotz vieler bekannter Enzyme gibt es immer noch verschiedene Bindungen, für die noch kein passendes Enzym gefunden wurde. Durch Enzyme Engineering ist es möglich die katalytischen Eigenschaften eines Enzyms zu verbessern, oder seine Substratspezifität bzw. die Art der Verknüpfung, die es katalysiert, zu verändern. In diesem Projekt soll das Enzym Lipopolysaccharyl-alpha-1,4- galactosyltransferase C (LgtC) aus Neisseria meningitidis, das den Transfer einer Galaktose von UDP-Galaktose zu einer endständigen Laktose ermöglicht, untersucht werden. Der Mechanismus dieser Reaktion ist noch nicht restlos geklärt. Um die katalytischen Konstanten von LgtC für die Übertragung von Galaktose auf Laktose und auf N- Acetyllaktosamin zu verbessern, wird eine Kombination aus rationalem Engineering und gerichteter Evolution verwendet. Dazu werden Aminosäuren in und um das katalytische Zentrum mit Hilfe der saturation mutagenesis mutiert, außerdem werden zufällige Mutationen via error prone PCR in das Gen eingeführt. Die so entstandenen Genbibliotheken werden in E. coli exprimiert, mit den jeweiligen fluoreszenz-markierten Zuckern inkubiert und anschließend bezüglich ihrer, je nach Aktivität unterschiedlich hoher, Fluoreszenz in einem Durchflußzytometer (FACS) sortiert. Positive Mutanten werden sequenziert und die zugehörige Enzymvariante wird gereinigt, charakterisiert und zusätzlich mittels Dünnschichtchromatographie auf die Verwendung alternativer Donorzucker getestet. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist es die Art der Verknüpfung, die LgtC katalysiert, zu verändern. Dazu wird für das Screening 4-Fluorolaktose verwendet, die an der C-4 Position nicht reagieren kann. Daher erscheinen nur die Zellen im Screening mit höherer Fluoreszenz, die die beiden Substrate an anderer Stelle verknüpfen können. Dieses Projekt kann nicht nur ein verbessertes Werkzeug für die Oligosacharidsynthese zur Verfügung stellen, sondern es können auch wertvolle Informationen über die Funktion der Aminosäuren an den untersuchten Positionen gewonnen werden, die helfen können, den bisher unklaren Reaktionsmechanismus besser zu verstehen.