Biophysikalische Untersuchungen der Pilus Biogenese in UPEC

Bei der Erkennung und Anlagerung von krankheitserregenden Bakterien an den Wirt spielen bakterielle Pili eine bedeutende Rolle. Die am häufigsten vorkommenden bakteriellen Pili vermehren sich durch den sogenannten "Chaperon-Usher (CU)" Weg. Das vorliegende Projekt basiert auf der Untersuchung des Polymerisationsmechanismus von Untereinheiten in der CU Pilus Biogenese von Typ 1 Pili, die für die Anlagerung an die Blase verantwortlich und daher Auslöser für Blasenentzündungen durch Uropathogene Escherichia Coli sind. Ein alternierendes Modell über die Führung der Untereinheiten an die Membran wurde erstellt und wird mit der relativ neu entwickelten Methode "Site-directed Spin Labeling (SDSL)" in Kombination mit Elektronen Paramagnetischer Resonanzspektroskopie (EPR) getestet. Diese Methodenkonstellation eignet sich sehr gut zur Analyse von Strukturen und konformativen dynamischen Prozessen von Proteinen. Die Verwendung von continuous wave (cw) als auch Puls-EPR Techniken ist geplant. Mittels cw-EPR erhält man als Folge eines Störeinflusses Informationen über lokale Struktur, Lösungsmittelzugänglichkeit, Polarität der Umgebung und dynamische strukturelle Änderungen. Weiters können unter Verwendung von Puls-EPR Techniken präzise Distanzen bis zu 8 nm zwischen Spin-Labels bestimmt werden. Das ist vor allem in diesem Projekt relevant. Als Modellsystem wurde das Fim-System gewählt, welches für die Zusammensetzung von Typ 1 Pili verantwortlich ist. Frühere Studien führten zu der Annahme, dass abwechselnd die beiden Protomere des Usher- Moleküls (= ein Dimer von zwei FimD-Molekülen), "Sektret" und "Assistenten" Protomer, in der Rekrutierung der Chaperon-Untereinheiten beteiligt sind. Dieses Modell wird durch systematische Positionierung der Nitroxid-Spin- Labels am Chaperon-Untereinheit-Komplex und den N-Termini der Usher-Protomere getestet indem die Distanzen zwischen den Nitroxid-Spin-Labels gemessen werden. Die Distanz-Daten von Puls-EPR Messungen werden dann zur Erstellung von in silico Modellen über die wechselwirkenden Proteine herangezogen um damit 3-dimensionale Strukturmodelle der Komplexe zu verschiedenen Zeiten des Piliwachstums zu konstruieren. Die Aufklärung des Mechanismus der Typ 1 Pilus Biogenese wird durch das vorliegende Projekt unterstützt und die gewonnenen Erkenntnisse sollen als Basis für die Entwicklung von neuen therapeutischen Strategien dienen.